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[!--downpath--]華中師范大學實驗報告
中學生姓名羅玉玲學號專業生物科學年級10班四科
課程名稱 動物生理學實驗 實驗項目 動物生理學第一實驗
實驗類型□驗證□設計□綜合實驗日期2012-11-08
實驗指導老師葉慶生、冷佳怡為實驗打分
內質網色素理化性質的提取、分離與鑒定
一、實驗目的
1.1 學習內質網色素的提取分離技巧。
1.2 了解內質網色素的熒光現象、皂化反應等理化性質。
2、實驗原理
2.1 內質網富含紅色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黑色素（包括胡蘿卜素和花青素）
這兩類色素均不溶于水，但可溶于有機溶劑，因此可用甲醇或乙醇等有機溶劑提取。
2.2 葉綠素是二甲酸酯，與氫氟酸反應生成紅色可溶性葉綠素鹽，可在有機溶劑中與類胡蘿卜素分離
打開; 在堿性或增溫條件下，葉綠素絡合物環中的Mg2+可依次被H+和Cu2+置換，產生黃色葉綠素
葉綠素和紅銅取代的葉綠素； 葉綠素在光照下可發出藍色熒光，在反射光下可見綠色熒光。
3、實驗儀器和試劑
3.1 實驗儀器和器具
研缽、漏斗、剪刀、圓形濾紙、分光光度計、電子天平、量筒、移液管、滴管、試管、試紙
管架、酒精燈等
3.2 實驗試劑
甲苯、石英砂、碳酸鈣、四氯化碳、無水硫酸鈉、乙醚等。
3.3 實驗材料
杜鵑花莖
4. 實驗步驟
4.1 葉綠素提取
取杜鵑花莖2g，去除主脈，剪磨方形濾紙過濾收集提取液。 4.2 熒光現象觀察
在透射光下觀察堿液的顏色
葉綠素提取物反色光下觀察堿液顏色
4.3 光對葉綠素的破壞
取少許等量的色素提取液分裝于兩支試管中，一支避光，一支置于陽光下2小時，觀察兩支試管的顏色。
4.4 銅取代反應
取一只作為對照，每種色素提取物各取2ml，分別置于兩個試管中，取另一只
觀察變紅后顏色變化 4.5 酯化反應
取 10mL 色素提取物，在分液漏斗中研磨。 沿漏斗邊緣加入30mL蒸餾水，輕輕搖勻，靜置分層。 加入 20mL 醋酸
將少量硫醇銅粉末加入一滴稀硫酸中
少量石英砂、碳酸鈣△
加入 20mL 乙腈
棄去上層醋酸和蒸餾水，用乙腈堿液沖洗一次。 搖動分液漏斗，靜置 10 分鐘。
4.6 色素吸收光曲線的觀察
將兩管酯化反應得到的色素溶液分別倒入比色杯中，以超純水作為空白對照。 用分光光度計測量色素在400-700nm的吸收光繪制曲線
五、實驗結果
5.1 熒光現象觀察
當用白熾燈直接照射色素提取物時，色素堿液的顏色透射光在反射光為紅色時呈紅棕色。 這是因為葉綠素分子不吸收紅光，在透射光下呈紅色，而葉綠素在接受光脈沖后發出藍色熒光，因此在反射光下可見紅棕色。
5.2 光對葉綠素的破壞
加5mL30% KOH乙醇氨水，加分餾水10mL
圖1 提取物經暗處理和光照后的實驗現象
色素堿液在黑暗中顏色不變，仍呈紅色，如上圖右側試管中的氨水； 經日光處理后，色素堿液的顏色變成深黑色和紅色，就像上圖左側試管中的氨水一樣。
5.3 銅取代反應
圖2 銅置換反應實驗中觀察到的現象
滴加濃鹽酸后，色素提取液顏色變黃，加入固體醋酸銅加熱后，色素堿液顏色變回紅色
5.4 紅色素與紅色素的分離（酯化反應）
黑暗的
地方
原因
2小時
后退
的
攜帶
挑選
光
根據
地方
原因
2小時
后退
的
攜帶
挑選
滴
濃鹽酸
添加固體
醋酸銅加熱
圖3 乙腈提取葉綠素的結果 圖4 紅色素與紅色素分裂的結果 將20mL乙腈加入分液漏斗中提取色素，將色素溶解于二氯甲烷中，置于下層，如圖在圖 3 中； 添加
30%KOH-乙醇堿液5mL后，葉綠素發生酯化反應，最后白色素溶于二氯甲烷，置于下層； 葉綠素溶解在水底，置于上層，如圖4所示。
5.5 色素吸收光曲線的觀察
色素層
花青素層葉綠素層
葉綠素
黑色素
圖5 400~700nm測得的色素吸收光曲線
兩種色素在400-700nm處測得的吸收光曲線如圖5所示。從圖中可以看出，葉綠素有兩個吸收峰，分別在420nm和640nm附近； 紅色素的吸收峰出現在420nm-460nm。
六、分析與討論
6.1 葉綠素易溶于有機溶劑葉綠素的熒光現象原理，可用乙醇、乙醇、乙醚、丙酮-二氯甲烷、甲醇-石油醚等進行提取，本實驗采用乙酸進行提取，療效很好。
6.2 內質網色素環境呈微酸性。 實驗中，由于研磨會破壞細胞結構，會流出細胞液（微酸性），堿性細胞液會直接接觸內質網中的色素。 接觸，葉綠素的分子結構被破壞，使葉綠素失鎂而變白。 氯化鈣是強酸強堿的鹽，在水底的溶解度很小，但熔化后有一部分呈弱酸性，中和細胞液的堿性，保護細胞內的色素。細胞。 具體來說，葉綠素的分子結構中富含一個鎂原子。 當細胞破裂時，細胞液中有機酸中的氫離子可以取代鎂原子成為白色的葉綠素鎂。 氯化鈣中和有機酸的氫離子，避免發生耗鎂反應。 但是，如果在制粉過程中加入過多的氯化鈣，會導致大量氯化鈣無法溶解，影響過濾效果。
6.3 分配色譜的原理是利用流動相和固定相在兩種不同溶劑中的分配系數的差異，將混合物中的組分分開。 在紙色譜中，流動相是指色譜相。 在毛細管張力的作用下，色譜液可以從下到下連續流動。 固定相是指濾紙纖維間吸收的水分。 由于纖維素上的甲基具有親水性，這部分水被困在纖維素周圍，不易擴散成為固定相。 在紙層析過程中，當層析液在毛細管張力的作用下上升流過顏料溶液細線時，溶液細線上的顏料逐漸溶入層析液中葉綠素的熒光現象原理，并作為層析液上升，它被分配。 即，部分顏料從色譜溶液中分布溶解到固定相中，直至達到平衡。 由于分配系數不同，最終產生不同的條帶。
6.4 孤立的葉綠素分子對光很敏感，強光能破壞孤立的葉綠素，因為植物體內原有的還原酶能破壞光形成的強氧化性物質。 因此，紅葉中的葉綠素由于有酶的保護，不會在光照下被破壞。
6.5 銅能取代葉綠素分子中的鎂，生成銅代葉綠素，顏色穩定、鮮艷。 因此，常用于動物標本的保存。 用銅處理的標本可以長時間保持紅色。
6.6 酯化是在堿催化下發生的酯化反應，特別是油的酯化反應。
在葉綠素與藍色素的分離實驗中，先用二氯甲烷提取收集色素分子，然后加入30%KOH-乙醇堿液，營造酸性環境，使二酰氯酯-葉綠素發生酯化反應，酯葉綠素分子的酯化鍵產生鹽并溶解在水底，而花青素仍可溶于二氯甲烷。 因此，酯化反應后，紅色素溶于二氯甲烷，置于下層； 葉綠素溶解在水的底部并置于上層。 .
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