譚慧杰, 杭寶建, 石峰, 李俊
山東省食品藥品檢驗研究院
概括
目的：為生物類似藥的研究開發提供借鑒和參考。
方法:通過查閱大量國內外文獻,結合生物類似藥的相關法規,梳理生物類似藥的理化性質、生物活性、純度與雜質、免疫學性質等藥劑學性質,并對相關的分析方法進行總結分析。
結果與結論：生物仿制藥的開發需要采用先進、靈敏的技術和方法表征生物仿制藥的質量屬性，評價生物仿制藥與參比藥的相似性。本文對生物仿制藥藥劑學性質分析方法的相關研究進行綜述，為生物仿制藥的開發和質量控制提供參考。
文本
生物類似藥是指在質量、安全性、療效等方面與已注冊的參照藥品相似的生物制品[1]。生物類似藥主要包括單克隆抗體、重組細胞因子蛋白、重組激素等。隨著早期上市生物技術藥物相關專利到期，以及有利于提高藥品可及性、降低藥價、滿足更多患者臨床用藥需求的生物類似藥的出現，我國已將生物制藥定位為國家戰略性新興產業。在政策、研發、資本、臨床需求等刺激下，我國掀起了生物類似藥發展的浪潮。
為規范生物類似藥研發與評價工作，促進我國生物類似藥市場發展，2015年，原國家食品藥品監督管理局藥品審評中心（CDE）發布《生物類似藥研發與評價技術指導原則（試行）》[1]，明確了生物類似藥的定義，提出了生物類似藥研發與評價的基本原則，對生物類似藥的藥學、非臨床和臨床研究與評價提出了具體要求；2021年，CDE發布《生物類似藥相似性評價與適應癥外推技術指導原則》[2]，對生物類似藥的定義、相似性評價體系、適應癥外推原則等作了進一步闡述。 生物仿制藥的相似性評價將貫穿整個研發過程，主要包括：藥學性質研究、非臨床研究、臨床研究，其中藥學相似性研究是支撐生物仿制藥研究的基石。生物仿制藥的藥學性質研究主要包括理化性質、生物活性、純度與雜質、免疫學性質四個方面。有效的藥學對比分析實驗依賴于可靠的分析方法和能力。本文主要針對生物仿制藥藥學性質的分析方法研究。
物理和化學特性
生物仿制藥是由氨基酸殘基通過肽鍵連接而成的蛋白質大分子藥物，具有一級結構和高級結構[3-4]。生物仿制藥的一級結構是指肽鏈中氨基酸的數量、組成和順序，決定了高級結構的形成，而高級結構與生物仿制藥的理化性質和功能直接對應。生物仿制藥一級結構和高級結構的表征是生物仿制藥理化性質研究的主要內容。
1.1 一級結構分析
一級結構是生物仿制藥最基本的結構，是其高級結構和功能的基礎，對藥物的活性和穩定性有重要影響。一級結構研究項目主要包括：完整分子量、氨基酸序列及修飾、糖基化、二硫鍵分析等。
1.1.1 完整分子量分析
完整蛋白質分析不會破壞蛋白質樣品，保證結構的完整性并保留翻譯后修飾。色譜、電泳和質譜技術目前廣泛應用于完整蛋白質分析，可以提供完整蛋白質的分子量等信息。完整蛋白質分析中常見的技術包括凝膠電泳、尺寸排阻（SEC）-高效液相色譜（HPLC）、基質輔助激光解吸電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）質譜。凝膠電泳和SEC-HPLC具有快速、便捷、重現性好的優點，廣泛應用于不同開發階段的生物仿制藥和參比藥的分子量對比分析。但這兩種方法的質量精度相對較低，不能提供樣品的精確分子量[5]。 MALDI和ESI質譜技術已成為測定完整蛋白質分子量最常用的方法之一，包括完整分子量、還原分子量、N-糖裂解后分子量以及輕重鏈分子量等。采用自上而下的分析策略，將完整分子量樣品碎裂，然后進行質譜分析，可以表征氨基酸序列、氨基酸修飾和蛋白質亞型[6-8]。
1.1.2 氨基酸序列及修飾分析
基于質譜的肽圖分析是生物仿制藥氨基酸序列及修飾分析的常用方法。它是一種自下而上的方法[9]，利用高特異性的蛋白酶作用于特定的肽鏈位點將肽切割成小片段，基于納液相色譜分離肽段，再利用高分辨率質譜進行分析。肽分析常用的蛋白酶包括胰蛋白酶、LysC、GluC、Asp-N、胃蛋白酶等，不同蛋白酶具有不同的特異性切割位點，使用不同的蛋白酶及聯合使用可以提高序列覆蓋率[10]。納液相色譜-高分辨率質譜聯用可以識別肽段序列及脫酰胺、氧化、糖基化等各種氨基酸修飾。 通過比較未修飾的末端肽，可以識別末端修飾的變化（例如 C 末端賴氨酸裂解和 N 末端焦谷氨酸形成）[11]。
1.1.3 糖基化分析
由于大部分生物仿制藥采用哺乳細胞表達系統，細胞內存在復雜的翻譯后修飾和酶反應，導致表達產物的糖基化分子結構多樣性，生產工藝和細胞株的細微變化都可能導致目標蛋白糖修飾基團結構發生明顯差異。糖基化對蛋白質的穩定性、構象、結合親和力和活性等都有重要影響，是治療性蛋白質藥物的關鍵質量屬性之一[12-13]。生物仿制藥的糖基化主要以糖基化位點、組成和分支為特征。完整蛋白質的質量分析可以確定蛋白質的主要糖型，但很難確定糖基化位點。糖基化位點主要通過糖肽分析來識別。通常用胰蛋白酶等蛋白酶對完整蛋白質進行酶解，產生小肽。 經色譜或電泳分離后，可進行串聯質譜分析，確定糖肽氨基酸序列和糖基化位點硫酸鈉的相對分子質量，但糖肽分析對于寡糖類型的分析不夠全面[14-15]。寡糖類型分析通常采用酶法或化學方法，將寡糖從完整蛋白質中游離出來[16-17]，例如N-糖苷酶F可裂解蛋白質結構中N-乙酰葡萄糖胺與天冬酰胺之間的酰胺鍵，肼解可裂解N連接寡糖，β-消除可裂解O連接寡糖。游離寡糖的分析方法通常有陰離子交換色譜法、直接質譜法和衍生化質譜法三種。寡糖結構不含發色團，常標有熒光試劑，用于光譜檢測。 例如N-寡糖的分析常采用8-氨基萘-1,3,6-三磺酸作為衍生化試劑，衍生化后再用熒光進行檢測。雖然質譜可以直接檢測寡糖，但是利用衍生化試劑對寡糖進行衍生化可以大大提高質譜檢測的電離效率，并提供更多的碎片結構信息。
1.1.4 二硫鍵分析
二硫鍵是多肽和蛋白質中常見的翻譯后修飾，是由氨基酸序列中兩個半胱氨酸殘基的巰基氧化而形成的共價鍵。二硫鍵不太穩定，氧化形成的二硫鍵也可以被還原形成游離巰基，因此二硫鍵通常是動態變化的化學鍵。蛋白質和多肽中的二硫鍵對其熱力學、力學和化學穩定性至關重要，也參與調控蛋白酶的抗性和活性。準確、快速地定位蛋白質和多肽中二硫鍵配對模式是研究其結構與功能的重要內容之一[18]。常用的二硫鍵分析方法是非還原酶水解-質譜法，利用酶對蛋白質進行非還原酶水解生成多肽。 通過質譜檢測到每個肽的具體信息后，利用二硫鍵特異性搜索軟件（pLink-SS）[19]對二硫鍵配對模式進行表征。
1.2 高級結構分析
生產工藝和制劑的改變可能導致維持蛋白質藥物功能的高級結構發生變化，進而影響藥物療效和免疫原性。高級結構分析常用的方法有圓二色譜(CD)[20]、差示掃描量熱法(DSC)[21]、氫-氘交換(HDX)-質譜(Mass MS)[22]等。遠紫外CD數據可以反映蛋白質α螺旋、β折疊、轉角和不規則卷曲的比例，可以快速計算出溶液中蛋白質的二級結構；近紫外CD數據可以反映蛋白質側鏈發色團如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等殘基的排列信息和二硫鍵微環境的變化，蘊含著豐富的蛋白質三級結構信息。通過測定蛋白質等生物大分子的CD，可以獲得生物大分子的結構信息。 CD在蛋白質折疊、蛋白質構象研究及酶動力學等領域有著廣泛的應用。DSC的工作原理是同時加熱或冷卻參比池和樣品池中的緩沖液或樣品，測量兩者保持相同溫度所需的熱量差。DSC可以分析蛋白質高級結構的變化，研究各種貯存因素對制劑穩定性的影響。HDX-MS的基本原理是利用蛋白質中不穩定氫原子可以與溶液中的氘原子交換的特性來研究蛋白質結構。首先將蛋白質分子溶解在重水中，由于不同類型氫原子的氫-氘交換速率不同，蛋白質表面的氫原子與重水接觸更緊密，交換速率比位于蛋白質內部或參與形成氫鍵或鹽橋的氫更快。交換反應后，蛋白質被酶切，通過MS檢測不同肽段的氫-氘交換速率，最終得到蛋白質的空間結構信息。 HDX-MS是研究蛋白質三維結構的有力工具，是傳統生物物理方法的重要補充，廣泛應用于蛋白質結構與動態變化研究、活性位點識別等。
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生物活性
生物活性測定是測定藥物對機體生物學作用的方法，在生物仿制藥的研發和質量控制中至關重要。生物活性測定方法包括：在體動物實驗、基于細胞系的生物活性分析方法、基于轉基因細胞系的生物活性分析方法。
動物實驗通過測試藥物在實驗動物身上的藥效學作用來反映藥物的生物活性，在藥物研發中起著重要作用。然而，動物實驗復雜且變化性大，大多數動物實驗已被細胞實驗所取代。然而，動物實驗方法，即網織紅細胞法，仍然用于確定具有復雜作用機制的生物技術藥物的體內生物活性，例如重組人促紅細胞生成素（ERP）[23]。
隨著高通量藥物篩選平臺的建立和生產規模的擴大，以及3R（、、）原則被科學家接受，人們越來越多地尋求動物實驗的替代品。基于細胞的生物活性分析方法因其高通量、高效率、高精度等優勢，越來越受到研究人員和制造商的青睞。許多生長因子的活性是由其對靶細胞的增殖促進作用決定的，例如表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）[24]。
對于沒有強反應性細胞株或不易檢測的細胞效應的生物技術藥物，構建轉基因細胞株成為一個很好的選擇。轉基因細胞株的構建是在對藥物作用機制進行全面深入研究的基礎上，通過體外模擬創新藥物的信號轉導機制，以引入藥物作用受體報告基因或效應分子為策略，構建了一系列簡便、快速、準確、安全、替代動物的轉基因活性評價模型。余蕾等[25]將胰島素促分泌肽天然受體的熒光素酶報告基因和信號分子cAMP同時引入CHO-K1細胞，建立了檢測胰島素促分泌肽融合蛋白生物活性的報告基因方法，并成功應用于胰島素促分泌肽活性的測定。
純度和雜質
純度是生物技術藥物的關鍵質量指標，生物類似藥與原研藥純度的差異可能導致其在人體內的藥代動力學特征和免疫原性不同，進而導致體內療效的差異，甚至可能引起嚴重的過敏反應。雜質主要包括產品相關雜質和工藝相關雜質。
3.1 產品相關雜質分析
蛋白質藥物在生產和儲存過程中，可能由于錯誤折疊、不完全組裝、降解、聚集等原因，產生不同分子量的產物，復雜的翻譯修飾和降解過程可產生不同的電荷異構體，產品相關雜質主要包括分子量異構體和電荷異構體[26]。
3.1.1 分子量大小變異分析
SEC-HPLC和電泳是檢測分子大小變異體的常用方法。SEC是根據凝膠孔徑與聚合物樣品分子大小的相對關系進行分離的分析方法。SEC的優點是應用簡單、通量高；缺點是樣品稀釋可能導致可逆聚集體的解離，樣品與色譜基質之間可能存在相互作用，從而減少聚集體的數量，影響單體蛋白的檢測[27]。電泳法包括十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Gel，PAGE)和十二烷基硫酸鈉毛細管電泳[28](-SDS，CESDS)。聚丙烯酰胺凝膠具有網狀結構，具有分子篩效應，SDS-蛋白質復合物帶過量的負電荷，質荷比近似恒定，它在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移與其分子量成比例。 CE-SDS是將凝膠填充在毛細管內，在毛細管內形成分子篩，SDS-蛋白質復合物按分子量大小在毛細管內遷移，可有效減少組分的擴散，分離效率高。非還原SDS-PAGE和非還原CESDS不破壞樣品的二硫鍵，可以分析由二硫鍵連接的聚合物[29-30]。
3.1.2 電荷異構體分析
生物仿制藥在生產和儲存過程中，糖基化、降解、聚集等修飾和改變都會引起電荷分布的變化。電荷變異會影響藥物的組織分布和藥代動力學。例如，增加正電荷會增加藥物的組織停滯，降低血清清除率；降低正電荷會降低藥物的組織停滯，增加藥物的全身清除率。電荷變異體是質量控制的重點，有效的質量控制非常必要。電荷異質性分析的常用方法包括平板等電聚焦（IEF）、離子交換色譜（Ion-，IEC）、毛細管區帶電泳（Zone，CZE）、毛細管等電聚焦（CIEF）和成像毛細管等電聚焦（ICEF）。其中，IEF操作繁瑣，分辨率低，定量不準確；IEC、CIEF、iCIEF具有良好的分辨率和定量優勢；CZE通用性強，分析時間短，具有相當的分離度和準確性。 IEC、CZE和質譜法可用于進一步表征電荷異構體的分子量、序列、氨基修飾和其他特性[32-33]。
3.2 工藝相關雜質分析
生物技術藥物一般由微生物或細胞表達后進行純化，純化過程中殘留的宿主DNA、殘留宿主蛋白（HCP）、親和介質蛋白A（A、ProA）的脫落等均對人體構成安全威脅，工藝相關雜質是影響生物技術藥物純度的另一關鍵因素。
3.2.1 宿主殘留DNA檢測
殘留DNA可能帶來感染或致突變風險，如連續培養細胞中的DNA具有致瘤性[34]。2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）第四部[35]規定CHO細胞中殘留DNA不得超過10pg/劑。《中國藥典》第四部收錄的宿主殘留DNA檢測方法有三種：DNA探針雜交法、熒光染色法和熒光定量PCR法。其中，DNA探針雜交法繁瑣費時，不能定量分析；熒光染色法特異性差，靈敏度低；熒光定量PCR法具有靈敏度高、準確性好、簡便快速等優點，是檢測DNA殘留的常用方法[36]。
3.2.2 HCP檢測
HCP具有誘發免疫反應的潛在安全風險，常見的檢測方法有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）。ELISA主要依靠抗體對HCP的特異性識別，具有靈敏度高、檢測簡單等優點，但HCP特異性抗體制備周期長、成本高、失敗風險高，且無法檢測因工藝改變而新引入的殘留蛋白，無法對HCP進行定性分析。與傳統ELISA法相比，HPLC-MS法開發時間短（僅需數周），且可對所有HCP進行無偏的定性和定量分析，在HCP雜質分析中越來越常用[37-38]。
3.2.3 Pro A殘留檢測
Pro A來源于金黃色葡萄球菌，含有5個結構域，能與抗體IgG分子的Fc段特異結合，是一種抗體結合蛋白，被廣泛用作純化Fc融合蛋白和單克隆抗體的親和介質[39]。在抗體純化過程中，Pro A可從柱子中浸出，造成污染。Pro A作為金黃色葡萄球菌的膜蛋白，具有免疫原性，控制其殘留水平是保證藥物安全的重要指標。ELISA是Pro A殘留的主要檢測方法，但Pro A能與IgG分子結合，從而阻礙其與相應抗體的結合，常導致檢測結果不準確。因此，在建立Pro A檢測方法時，應考察方法的精密度和準確度[40]。
免疫學特性
免疫學特性是指藥物刺激機體形成特異性抗體或致敏淋巴細胞的特性。免疫學特性評價是生物仿制藥質量控制的重要內容，主要包括生物仿制藥與FcRn、Fcγ、c1q等靶點和受體的親和力、補體依賴性細胞毒活性（CDC）以及抗體依賴性細胞介導的細胞毒活性（ADCC）。
4.1 對靶標和受體親和力的評估
評價生物仿制藥與靶點及受體親和力的主要方法有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、細胞酶聯免疫吸附試驗（）[41]、表面等離子體共振（SPR）滴度測定法[42-43]。ELISA是評價藥物與靶點及受體親和力的常用方法，操作相對簡單，耐久性好，但需要制備抗原。細胞酶聯免疫吸附試驗（ELISA）與ELISA的原理基本相同，只是將可溶性抗原展示于細胞表面，通過流式細胞術測定細胞陽性率指數，檢測受試抗體與標記抗體的競爭性結合。該方法的優點是避免了抗原的制備和純化過程，特別適用于難以制備的抗原；展示于細胞表面的抗原的空間結構更接近于在體內的存在形態，使檢測結果更能反映藥物在體內的活性狀態。
SPR是分析生物分子間相互作用的新技術，被正式收錄于2020版中國藥典第四部。其具體測量過程為：將抗體固定在芯片表面，待測抗原通過微流控系統流過芯片。抗原抗體一旦結合，芯片表面物質的質量濃度就會升高，從而引起芯片表面液體的折射率發生變化而被檢測到。該技術在測量抗原抗體結合活性時不需要標記，避免了標記對分子結構的影響，能更真實地反映抗原與抗體的結合情況。其測量周期短，所需樣品量少，一般僅在微克級，可用于微量樣品的測量。 SPR技術可用于抗體-抗原結合活性分析、抗體候選物的篩選與評價、以及抗體-受體結合活性分析，如抗體與FcγRIIIa、FcγRIIIb等受體結合的親和力、動力學信息等。
4.2 CDC活性測定
CDC是指補體的細胞毒作用，即通過特異性抗體與細胞膜表面相應抗原的結合，抗體Fc片段的補體結合位點暴露出來，與補體C1結合形成復合物，激活經典補體途徑，形成的膜攻擊復合物（MAC）引起細胞外離子大量內流，最終導致腫瘤細胞裂解。抗CD20
單克隆抗體[44]的活性主要由CDC決定。選擇CD(of)抗原表達較高的細胞接種，使抗體能充分與細胞表面抗原結合，然后加入補體孵育硫酸鈉的相對分子質量，與細胞表面結合的抗體激活補體成分，殺傷細胞。補體成分多，熱不穩定，易失活，其來源包括正常人血清、豚鼠、兔等。補體的選擇及其質量的控制是CDC活性測定的關鍵環節。
4.3 ADCC活性測定
ADCC是指抗體藥物通過Fab片段特異性地與靶細胞（病毒感染細胞和腫瘤細胞）表面的抗原決定簇結合的過程。抗體藥物的FC片段可被NK細胞等細胞毒性細胞的Fc受體（FcR）識別并結合，從而殺死靶細胞。早期的ADCC驗證方法多以新鮮制備的外周血單核細胞或NK細胞作為效應細胞進行殺傷試驗，但這些方法存在細胞分類培養困難、操作繁瑣、背景值高、受個體差異影響等缺點。研究[45]表明，NK細胞中Fc受體（FcR）活化，特別是受體（CD16）活化，可以激活活化T細胞的核因子（NF-κB）。NFAT信號通路是一條調控熒光素酶表達的通路。 利用基因工程方法在細胞表面穩定表達Fc受體，構建細胞內NFAT信號驅動熒光素酶表達的基因回路，將熒光素酶與生物發光偶聯。當抗體Fc片段與細胞表面Fc受體結合時，NFAT信號通路受到刺激，熒光素酶表達增加，通過生物發光測定ADCC活性。該方法簡便易操作，特異性強，重復性好，準確性高，可直接檢測抗體Fc片段與Fc受體結合的能力[46]。
結論
生物仿制藥分子量大、結構多，對其質量控制提出挑戰。應采用先進、靈敏的方法通過比對試驗研究生物仿制藥的理化性質、生物活性、雜質與純度、免疫學性質等藥劑學性質。首先可考慮采用與參比藥一致的方法，對于其他技術和方法應提供依據，對于某些關鍵質量屬性，應采用多種方法進行比較試驗。本文整理了生物仿制藥藥劑學性質的研究項目和分析方法，對國內生物仿制藥研發企業的質量控制具有重要的指導作用和參考價值。
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