細胞膜顏料+外泌體顏料雙染策略，徹底解決外泌體攝入實驗中的假陰性問題。
外泌體的細胞攝入實驗中有兩個無法回避的問題：
1）集聚導致的假陰性：常規親脂性顏料在水氨水中自發產生顏料集聚體或結節，無法吹散，集聚顏料的螢光訊號極易與外泌體混淆，導致觀測結果的假陰性；
2）二次標記導致的假陰性：因為外泌體膜與細胞膜結構的相像性，常規顏料標記的外泌體在被細胞攝入后一旦開裂細胞膜選擇性通透，會二次標記細胞膜帶來非外泌體螢光訊號。
那有哪些染色方式可以完美解決上述的兩個困局呢？
：99%標記率，不二次標記的膜特異性顏料
基于Tech.技術開發的具有極高的特異性和低于99%的標記率，且一旦從外泌體表面開裂，其活性羧基即刻變性失活，掉落的僅發出難以被測量的微弱螢光，不再對膜結構二次標記，防止顏料二次標記帶來的假陰性。Fig.1分別為對外泌體的標記率及物理模擬活性羧基變性后對外泌體的標記率：
Fig.1（a）505對外泌體的標記率與（b）物理模擬開裂的的505結構對外泌體的標記率
不集聚、不彌散的“真實”染色
通過共價偶聯外泌體膜而實現標記發光，防止了兩大“假陰性”：
1）非親脂性顏料細胞膜選擇性通透，無集聚趨勢，防止了因顏料集聚帶來的假陰性；
2）不彌散，僅標記外泌體膜輪廓，不標記細胞膜，防止了顏料彌散二次著色細胞膜帶來的假陰性。Fig.2為彌散性親脂顏料DIO標記的外泌體與非彌散性505標記的外泌體被U251細胞攝入結果對比，可以見到顯著的DIO彌散標記細胞膜的痕跡。
Fig.2彌散性親脂顏料DIO標記的外泌體（a）與非彌散性505標記的外泌體（b）被U251細胞攝入
保留外泌體結構
被廣泛應用于各類動動物細胞來源的外泌體的體內外示蹤劑，對外泌體的形態學及其生物學功能的影響微乎其微。我們對標記后的外泌體進行TEM、和blot表征（Fig.3），發覺：
1）標記后的外泌體在透射電鏡下依然保持標志性的外泌體茶托狀結構；
2）標記后外泌體平均粒徑分布差別不顯著，僅降低~5nm，這是大量均勻的負載在外泌體表面的結果；
3）blot顯示標記前后蛋白的條帶位置不變，說明不會標記外泌體表面蛋白。
Fig.3被（a）標記后和（b）標記前的外泌體的TEM圖象；被（c）標記后和（d）標記前外泌體的粒徑剖析（）;（e）標記前后的外泌體blot：左為標記前的外泌體，右為經標記后的外泌體。
+雙染策略
基于Tech.技術開發的系列顏料具有同樣的膜標記特征，可以清晰的詮釋細胞膜輪廓，與結合可以完美實現外泌體被細胞攝入實驗。Fig.4為505標記的外泌體+標記細胞膜和PKH-67標記的外泌體+F-actin攝入實驗對比，圖Fig.4a中可以見到555標記的清晰的綠色膜輪廓，經過505標記后的紅色外泌體分散在細胞膜內；Yu等使用F-actin標記細胞膜輪廓，PKH-67標記外泌體，雖然共聚焦顯微鏡下觀測到的外泌體明亮的紅色螢光，但是該紅色螢光呈彌散狀分布，無法較好分辨外泌體與細胞膜。
Fig.4（a）505標記的外泌體+標記細胞膜和（b）PKH-67標記的外泌體+F-actin標記細胞膜攝入實驗對比
悉心的朋友可能注意到了，為何merge中有紅色光點呢？這要從實驗操作中找尋紅色光點的身分。有了+極佳的顏料組合，只需兩步即可完成外泌體攝入實驗：1）首先用標記外泌體，除去游離顏料后，與細胞共培養，此時細胞吞噬標記的外泌體；2）使用標記細胞膜，PBS驅走游離顏料后，共聚焦顯微鏡下觀測即可。
Fig.5中，黑色表示細胞膜，紅色表示外泌體，白色顆粒狀表示被+雙染的區域，也就是未完全步入細胞膜的外泌體。
Fig.5（a）555（U251細胞膜）+505（果汁外泌體）雙染外泌體攝入實驗（b）555（A549細胞膜）+505（果汁外泌體）雙染外泌體攝入實驗
因為無細胞膜選擇性（會標記外泌體）且完全不透過細胞膜，+雙染策略不僅僅可以看見被細胞攝入的外泌體（紅色），能夠清晰區分出沒有完全步入細胞膜的外泌體（藍色）。
基于Tech.開發的和因為上述特點，+雙染技術，可以幫助科學家完美解決外泌體攝入實驗中的假陰性問題。
