2022年4月29日，來自加洲學院戴維斯校區的B.院長課題組在刊物上發表了一篇關于借助抗原介導的針對膜蛋白互作的物理毗鄰標記方式，可以在原位發覺與鑒別膜蛋白互作的蛋白組。文章標題為“Afor–oncell”。（原文鏈接：doi:）
跨膜和膜系蛋白占人類蛋白質組的30%以上細胞膜蛋白，在細胞通信和訊號調節，物質交換等生物過程中必不可少。且膜蛋白是超過一半抗生素的靶標，在人體中發揮著至關重要的作用。而其中許多細胞過程，包括細胞訊號傳導和膜運輸，都涉及復雜的蛋白質-蛋白質互相作用，以達到共同完成生理功能的目的。[1]
通過傳統的pull-down技術來研究膜蛋白互作具有較大的挑戰。膜蛋白跨膜區的疏水特點，以及膜蛋白提取條件的復雜性，和膜受體與其下游訊號蛋白之間的瞬時或弱互相作用，都促使膜蛋白互作的鑒別困難重重。[2]據悉，因為完整脂單層的破壞，純化后的膜蛋白無法反映其在真實環境中的互作情況。
烷基自由基是一種蛋白標記官能團，其可以與蛋白的基團位點，如芐基與烷烴，發生反應，形成質量變化，并通過質譜測量到。[3]而則是一種常用的甲基自由基標記探針，其由一個EDTA螯合的鐵離子，和溴甲基苯基聯接單元組成。能將鐵離子固定到目標蛋白上，而鐵離子在二溴化氫存在的條件下形成烷基自由基，對附近的蛋白進行標記，以達到臨近標記的功能。[4]
作者借助該探針，設計了一種基于抗原的膜蛋白毗鄰標記方式，用標記抗原，通過抗體-抗原的特異性親和將探針定位至誘餌蛋白附近，并標記周圍的與誘餌蛋白互作的蛋白，再通過質譜測量即可得到膜蛋白的互作蛋白質，如圖1所示。作者將該方式命名為AAPL（–），并對其進行了一系列測試與應用。
圖1AAPL方式示意圖
作者設計了兩種針對抗體的探針聯接方案，第一種方式（圖2A），是將探針特異性地聯接至抗原Fc端的糖基化修飾處；而第二種FeAb（圖2B），則是隨機將探針聯接至抗原的酪谷氨酸殘基上。而后文章對這兩種聯接策略進行了應用與驗證。
圖2兩種探針標記策略與其對應療效
以前的研究早已得到最優的氧化標記條件，在此基礎上細胞膜蛋白，作者選擇了膜蛋白與ERBB2作為研究對象。ERBB2蛋白是一種受體酪谷氨酸蛋白激酶，其在20-30%的甲狀腺癌中被觀察到過度抒發，并造成下游調控的激活。[5]而是Na+/K+的一個催化亞基，被發覺在多種腫瘤組織中失調，也是多種強心苷類抗生素的靶向[6]。作者選擇了對應這兩種膜蛋白的特異性抗原，對兩種探針標記方式的好壞進行了探究。如圖2C所示，在不同標記條件的M1-M6實驗組中，技巧所在的M5組，與C1-C3組的對照組樣本相比，顯示了最大的氧化標記差別，證明了該條件的優勢。而且在圖2C一側的-ERBB2組中，實驗組與對照組樣本并未有顯著差別，說明針對的抗原，并未辨識ERBB2蛋白，證明了技巧的特異性。確認無誤后，作者對方式鑒別的確切性進行了剖析。
圖3AAPL與打分的交叉剖析
作者對其所得的氧化蛋白質組數據進行了深度剖析，將各個氧化肽所對應蛋白的氧化程度與產率進行綜合測算，得到AAPL評分。該評分反映該蛋白與誘餌蛋白的互作程度，并選出互作蛋白中打分較高的L1與L2組。而后通過將L1與L2組的數據與評分比較，對技巧與AAPL分數的可效度進行了驗證。
作者借助對蛋白間的互作程度進行評分，并將評分所鑒別到的蛋白分為T1-T4類，其與誘餌蛋白的互作相關度逐級升高，并把評分與APL評分數據進行交叉剖析（圖3）。結果表明，和AAPL方式將相像的蛋白鑒別為與誘餌蛋白的強互相作用因子，驗證了打分方式的可靠性。
圖互作蛋白網路與糖基化對互作的影響
接出來，作者對AAPL方式進行了三個應用測試。首先，作者針對先前選擇的和ERBB2，以及新選擇的LI-鈣黏蛋白CDH17（圖4A），勾畫了互作蛋白網路圖譜，并與已有的研究進行比較，側面印證了技巧的確切性。而后，作者就糖基化對蛋白互作的影響展開了研究，Kif()有推動高甘露糖N-聚糖在膜蛋白上抒發的療效，而SI(3Fax-)則有增加唾液酸化聚糖產率的能力，作者使用這兩種藥劑分別處理細胞，并進行了針對CDH17蛋白的互作鑒別（圖4B）。結果顯示，與對照組相比，聯接有高比列的高甘露糖聚糖的NOMO2與STT3A蛋白，在加入了Kif后，互作顯著強化；而聯接有唾液酸化聚糖的CEAM1、ATLA3、1AO2和VTNC，則是遭到了SI的影響，證明了糖基化確實對蛋白互作存在影響。
綜上，作者構建了一種基于抗原的膜蛋白物理毗鄰標記方式AAPL，對其進行了驗證與應用測試，勾畫了膜蛋白的蛋白互作網路圖。對于該方式，就重要性上而言，膜蛋白占蛋白總量的30%，起到多種受體，離子通道，細胞通信等作用，是多種抗生素的靶向，功能復雜。膜蛋白的互作在其發揮功能的過程中至關重要，是其正常行使功能的基礎，故，針對其的研究方式必不可少。但是，膜蛋白的研究仍然具有挑戰性，傳統方式如親和純化，因為膜蛋白無法提取純化，因而鑒別困難。而且膜蛋白離開質膜環境后，其環境與生物活性改變，類似脂類體等代替方式無法反映其真實生理環境。而AAPL方式，確實地鑒別到了抗體在細胞膜上的互作蛋白，并從多方位驗證了其確切性，證明了可行性。就通用性來講，AAPL方式利用抗體辨識底物，可研究的蛋白質范圍較廣，且無需對樣本進行基因操作，可以運用于多種生物樣本與生理調控過程。同時，AAPL方式也具有一定的局限性，其氧化肽未經富集，在復雜樣本中鑒別較為困難，且深受質譜的精確度影響，具有一定的隨機性，且對于得到的互作蛋白未進行進一步互作的生化驗證。而在拓展性的方面，AAPL方式可以用于多種抗生素或細胞分化的互作變化及生理調控的鑒別，在抗生素研究方面有廣泛的前景。且該方式可以對無法進行基因操作的樣本，如病理組織等，進行鑒別，可以在臨床樣本中發揮一定的功效。
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