2022年4月29日，來自加洲學(xué)院戴維斯校區(qū)的B.院長課題組在刊物上發(fā)表了一篇關(guān)于借助抗原介導(dǎo)的針對膜蛋白互作的物理毗鄰標(biāo)記方式，可以在原位發(fā)覺與鑒別膜蛋白互作的蛋白組。文章標(biāo)題為“Afor–oncell”。（原文鏈接：doi:）
跨膜和膜系蛋白占人類蛋白質(zhì)組的30%以上細(xì)胞膜蛋白，在細(xì)胞通信和訊號調(diào)節(jié)，物質(zhì)交換等生物過程中必不可少。且膜蛋白是超過一半抗生素的靶標(biāo)，在人體中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而其中許多細(xì)胞過程，包括細(xì)胞訊號傳導(dǎo)和膜運(yùn)輸，都涉及復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用，以達(dá)到共同完成生理功能的目的。[1]
通過傳統(tǒng)的pull-down技術(shù)來研究膜蛋白互作具有較大的挑戰(zhàn)。膜蛋白跨膜區(qū)的疏水特點(diǎn)，以及膜蛋白提取條件的復(fù)雜性，和膜受體與其下游訊號蛋白之間的瞬時或弱互相作用，都促使膜蛋白互作的鑒別困難重重。[2]據(jù)悉，因?yàn)橥暾瑔螌拥钠茐模兓蟮哪さ鞍谉o法反映其在真實(shí)環(huán)境中的互作情況。
烷基自由基是一種蛋白標(biāo)記官能團(tuán)，其可以與蛋白的基團(tuán)位點(diǎn)，如芐基與烷烴，發(fā)生反應(yīng)，形成質(zhì)量變化，并通過質(zhì)譜測量到。[3]而則是一種常用的甲基自由基標(biāo)記探針，其由一個EDTA螯合的鐵離子，和溴甲基苯基聯(lián)接單元組成。能將鐵離子固定到目標(biāo)蛋白上，而鐵離子在二溴化氫存在的條件下形成烷基自由基，對附近的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，以達(dá)到臨近標(biāo)記的功能。[4]
作者借助該探針，設(shè)計了一種基于抗原的膜蛋白毗鄰標(biāo)記方式，用標(biāo)記抗原，通過抗體-抗原的特異性親和將探針定位至誘餌蛋白附近，并標(biāo)記周圍的與誘餌蛋白互作的蛋白，再通過質(zhì)譜測量即可得到膜蛋白的互作蛋白質(zhì)，如圖1所示。作者將該方式命名為AAPL（–），并對其進(jìn)行了一系列測試與應(yīng)用。
圖1AAPL方式示意圖
作者設(shè)計了兩種針對抗體的探針聯(lián)接方案，第一種方式（圖2A），是將探針特異性地聯(lián)接至抗原Fc端的糖基化修飾處；而第二種FeAb（圖2B），則是隨機(jī)將探針聯(lián)接至抗原的酪谷氨酸殘基上。而后文章對這兩種聯(lián)接策略進(jìn)行了應(yīng)用與驗(yàn)證。
圖2兩種探針標(biāo)記策略與其對應(yīng)療效
以前的研究早已得到最優(yōu)的氧化標(biāo)記條件，在此基礎(chǔ)上細(xì)胞膜蛋白，作者選擇了膜蛋白與ERBB2作為研究對象。ERBB2蛋白是一種受體酪谷氨酸蛋白激酶，其在20-30%的甲狀腺癌中被觀察到過度抒發(fā)，并造成下游調(diào)控的激活。[5]而是Na+/K+的一個催化亞基，被發(fā)覺在多種腫瘤組織中失調(diào)，也是多種強(qiáng)心苷類抗生素的靶向[6]。作者選擇了對應(yīng)這兩種膜蛋白的特異性抗原，對兩種探針標(biāo)記方式的好壞進(jìn)行了探究。如圖2C所示，在不同標(biāo)記條件的M1-M6實(shí)驗(yàn)組中，技巧所在的M5組，與C1-C3組的對照組樣本相比，顯示了最大的氧化標(biāo)記差別，證明了該條件的優(yōu)勢。而且在圖2C一側(cè)的-ERBB2組中，實(shí)驗(yàn)組與對照組樣本并未有顯著差別，說明針對的抗原，并未辨識ERBB2蛋白，證明了技巧的特異性。確認(rèn)無誤后，作者對方式鑒別的確切性進(jìn)行了剖析。
圖3AAPL與打分的交叉剖析
作者對其所得的氧化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行了深度剖析，將各個氧化肽所對應(yīng)蛋白的氧化程度與產(chǎn)率進(jìn)行綜合測算，得到AAPL評分。該評分反映該蛋白與誘餌蛋白的互作程度，并選出互作蛋白中打分較高的L1與L2組。而后通過將L1與L2組的數(shù)據(jù)與評分比較，對技巧與AAPL分?jǐn)?shù)的可效度進(jìn)行了驗(yàn)證。
作者借助對蛋白間的互作程度進(jìn)行評分，并將評分所鑒別到的蛋白分為T1-T4類，其與誘餌蛋白的互作相關(guān)度逐級升高，并把評分與APL評分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行交叉剖析（圖3）。結(jié)果表明，和AAPL方式將相像的蛋白鑒別為與誘餌蛋白的強(qiáng)互相作用因子，驗(yàn)證了打分方式的可靠性。
圖互作蛋白網(wǎng)路與糖基化對互作的影響
接出來，作者對AAPL方式進(jìn)行了三個應(yīng)用測試。首先，作者針對先前選擇的和ERBB2，以及新選擇的LI-鈣黏蛋白CDH17（圖4A），勾畫了互作蛋白網(wǎng)路圖譜，并與已有的研究進(jìn)行比較，側(cè)面印證了技巧的確切性。而后，作者就糖基化對蛋白互作的影響展開了研究，Kif()有推動高甘露糖N-聚糖在膜蛋白上抒發(fā)的療效，而SI(3Fax-)則有增加唾液酸化聚糖產(chǎn)率的能力，作者使用這兩種藥劑分別處理細(xì)胞，并進(jìn)行了針對CDH17蛋白的互作鑒別（圖4B）。結(jié)果顯示，與對照組相比，聯(lián)接有高比列的高甘露糖聚糖的NOMO2與STT3A蛋白，在加入了Kif后，互作顯著強(qiáng)化；而聯(lián)接有唾液酸化聚糖的CEAM1、ATLA3、1AO2和VTNC，則是遭到了SI的影響，證明了糖基化確實(shí)對蛋白互作存在影響。
綜上，作者構(gòu)建了一種基于抗原的膜蛋白物理毗鄰標(biāo)記方式AAPL，對其進(jìn)行了驗(yàn)證與應(yīng)用測試，勾畫了膜蛋白的蛋白互作網(wǎng)路圖。對于該方式，就重要性上而言，膜蛋白占蛋白總量的30%，起到多種受體，離子通道，細(xì)胞通信等作用，是多種抗生素的靶向，功能復(fù)雜。膜蛋白的互作在其發(fā)揮功能的過程中至關(guān)重要，是其正常行使功能的基礎(chǔ)，故，針對其的研究方式必不可少。但是，膜蛋白的研究仍然具有挑戰(zhàn)性，傳統(tǒng)方式如親和純化，因?yàn)槟さ鞍谉o法提取純化，因而鑒別困難。而且膜蛋白離開質(zhì)膜環(huán)境后，其環(huán)境與生物活性改變，類似脂類體等代替方式無法反映其真實(shí)生理環(huán)境。而AAPL方式，確實(shí)地鑒別到了抗體在細(xì)胞膜上的互作蛋白，并從多方位驗(yàn)證了其確切性，證明了可行性。就通用性來講，AAPL方式利用抗體辨識底物，可研究的蛋白質(zhì)范圍較廣，且無需對樣本進(jìn)行基因操作，可以運(yùn)用于多種生物樣本與生理調(diào)控過程。同時，AAPL方式也具有一定的局限性，其氧化肽未經(jīng)富集，在復(fù)雜樣本中鑒別較為困難，且深受質(zhì)譜的精確度影響，具有一定的隨機(jī)性，且對于得到的互作蛋白未進(jìn)行進(jìn)一步互作的生化驗(yàn)證。而在拓展性的方面，AAPL方式可以用于多種抗生素或細(xì)胞分化的互作變化及生理調(diào)控的鑒別，在抗生素研究方面有廣泛的前景。且該方式可以對無法進(jìn)行基因操作的樣本，如病理組織等，進(jìn)行鑒別，可以在臨床樣本中發(fā)揮一定的功效。
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