本公眾號前期發表相關文章鏈接如下：
人紅細胞膜示意圖(包括了主要蛋白質的分子結構)
垂直作用為垂直于膜平面，以錨定蛋白和聯接蛋白復合物為代表，聯接膜血影蛋白骨架和嵌入脂類雙分子層的整個蛋白。水平互相作用為平行于膜平面，由血影蛋白四聚體和蛋白4.1R參與。b3：帶3蛋白；GPA/GPC：血型糖蛋白A/C；GLUT-1：藍莓糖轉運蛋白-1；：錨定蛋白；p55：鳥苷酸激酶(MAGUK)蛋白家族磷蛋白。(9th,2016.)
紅細胞膜結構與自身抗原的“分子時鐘”機制
紅細胞膜在紅細胞的功能和結構中起關鍵作用。它具有奇特的雙凹圓盤形狀，確保紅細胞具有良好的穩定性及變型能力，使紅細胞還能承受循環剪切壓力，當通過窄小的脾竇及微血管時才能承受反復的扭曲，保證120天的壽命。紅細胞膜表面保持非活化狀態，因此不粘附于內皮細胞或互相積聚而阻塞微循環。它具有選擇性通透屏障，保留細胞內的必要成份，并容許代謝產物排出。為了推動氣體的轉移和維持pH平衡，細胞膜進行氯離子和碳酸氫根陰離子交換，并控制陽離子和水的濃度。膜的隔離作用增加了外界對血紅蛋白及其他細胞成份的氧化傷害，而且通過可逆性地結合和選擇性地滅活糖酵解酶調節細胞代謝。(9th,2016.)
紅細胞膜是一個復雜的結構，包含一個相對流動的脂類雙分子層，由底層二維膜骨架穩定，維持了紅細胞雙凹圓盤狀的形態。骨架提供了細胞快速反復變型的硬度和柔硬度，這樣才能承受微循環毛細血管及腎臟中遇見的剪切撓度。脂類雙分子層包含磷脂和固醇以及必需的跨膜蛋白，通過與聯接蛋白的互相作用而固定在膜骨架上，將紅細胞胞漿與血清隔離開。無核紅細胞在人類細胞中是獨一無二的，由于其惟一的結構成分質膜決定了其各類抗體、運輸和機械特點。紅細胞的盤狀形狀是由網織紅細胞在48小時的成熟過程中首先在骨髓之后在循環中演化而至的。盤狀人類紅細胞的一個重要且明顯的特點是，在其120天的生命周期中，它還能在反復穿過微循環窄小的毛細血管(橫截面為其自身半徑的三分之一)時經歷較大的被動變型。這些特點最顯著的表現是在體內紅細胞從脾索轉移到脾竇的過程中以及體外流動造成的變型過程中(如右圖)。個別癌癥的異常紅細胞可因為變型性增加進而被脾隔離，致使紅細胞壽命減短及溶血性腎炎。(N,etal.Blood,2008.)
(左上)網織紅細胞；(右上)成熟盤狀紅細胞前體；(左下)穿過脾索到脾竇的紅細胞，注意紅細胞在通過分隔脾索和竇的窄小內皮狹縫時所經歷的顯著變型；(右右圖)盤狀紅細胞體外流動誘導變型形成的橢圓形細胞。
紅細胞脂類雙分子層約構成紅細胞膜重量的50%，包含幾乎等量的未水解固醇和磷脂以及少量糖脂和磷脂酰肌醇。紅細胞上的糖脂僅存在于膜的外側面，帶有伸向胞漿的碳水化合物，攜帶包括ABH、P等在內的數個重要紅細胞抗體。而內在或跨膜蛋白通過疏水互相作用嵌入在脂類雙分子層中，它們常常從雙分子層凸出延展到血清和/或紅細胞內部，這種結構特點與它們運輸蛋白、受體、信號分子和攜帶紅細胞抗體功能有關。大部份跨膜蛋白也定義了各類血型抗體，并表現出多種功能異質性，充當轉運蛋白、參與紅細胞與其他血細胞和內皮細胞互相作用的黏附蛋白、信號傳導受體以及其他仍未定義或發覺的活性等。(TJ,etal.,2021;9th,2016.)
毫無疑惑的，人紅細胞在其經歷的生存周期中會逐步邁向衰老并被消除。正常紅細胞壽命約120天，紅細胞的生命邁向終結最常見的形式是被巨噬細胞吞噬。巨噬細胞吞噬是一種高效的清理方法，每秒可吞噬約500萬個紅細胞，并不會造成循環中的血紅蛋白顯著下降。其實，必將存在一些訊號，使巨噬細胞可將年青的成熟紅細胞與受損的或則老化的紅細胞區分開來，這種訊號可能包括細胞變型性的增長和(或)膜表面特點的改變等。衰老的紅細胞被破壞可能存在幾種不同機制，因為標記的正式破壞的細胞最后會被消除，在外周血中濃度很低或沒有，因而確定紅細胞真正破壞機制非常困難。許多初期的資料是通過研究密度較高的細胞所得，這群細胞被覺得是“老化的”，而目前覺得并非這么。網織紅細胞在成熟過程中線粒體和內質網體逐漸消失，細胞密度驟然降低，而且紅細胞成熟后步入血管幾天后，紅細胞密度不再進一步降低，其他數學特點也不再改變，所以紅細胞密度不能作為紅細胞衰老的標志，這促使標志紅細胞將被破壞的衰老改變的研究十分困難。以前，有很大部份研究覺得紅細胞膜帶3蛋白的改變及膜磷脂酰甘氨酸的曝露作為紅細胞衰老改變的候選標志物，可能具有重要意義。(LutzHU,etal.Front,2013;9th,2016.)
這涉及到對紅細胞衰老機制的研究提出的一個重要假定，主要是由Kay在20世紀80年代早期完成的，即人類紅細胞衰老是因為天然存在的自身抗原引起衰老紅細胞膜上帶3成份的變化。(KayMM.,1985.)
而為了驗證這個假定，2021年10月日本艾伯塔學院E等人借助共聚焦顯微鏡和蛋白質物理方式測量了紅細胞膜帶3蛋白的一個具有未知性的拓撲結構(帶3蛋白多肽的812-830區域)的構型改變，此類動力學改變提供了一種可能的“分子時鐘”機制，因而解釋了IgG自身抗原在衰老紅細胞上的集聚，并最終造成了巨噬細胞對老化紅細胞的吞噬和清理的機制(右圖)。(KE,etal.Acta,2021.)
紅細胞“分子時鐘”模型
如上諸圖所示，帶3蛋白(白色，顯示為二聚體)是一個雙結構域蛋白，由一個完整的膜結構域(M)和一個由靈活的聯接體聯接到細胞質內的結構域(C)組成。帶3蛋白的812-830區域(檸檬色橢圓形)主要是坐落細胞質中的(State1)，但可以暫時性重新定位到細胞外環境(State2)。這些短暫的重新定位將812-830抗體決定簇區域放在了胞外具有免疫反應性的538-554區域(藍紅色橢圓形)后面。這些先前未知其明晰作用的812-830區域細胞外的官能團可以在胞外與循環中細胞衰老相關的人自身抗原(IgG，白色Y形)互相作用，造成帶3蛋白作為特異性抗體被自身抗原不可逆地捕獲，當自身抗原簇在紅細胞表面集聚達到一定程度的密度閥值時(“分子時鐘”機制的精準調養下，達到閥值時刻即為該紅細胞生命期的終點)，巨噬細胞開始辨識該紅細胞并啟動吞噬作用機制。而如胞外的812-830抗體決定簇區域不被自身抗原捕獲，則812-830區域仍可重新回復到其原有的細胞內定位。這些機制，為其形象地命名為“分子時鐘”機制。
帶3蛋白膜結構域X射線晶體結構
(分子時鐘主要機制)
帶3交替構型的模型。顯示了在晶體結構中的帶3膜結構域(，左)，及與812-830區域(，右)的細胞外可及性建模交替構型。分別從脂類雙分子層(下層)和細胞外環境(上層)的平面視角觀察帶3蛋白。紅色顯示膜脂，并突出顯示了兩個紅細胞衰老相關抗體表位:殘基812-830(檸檬色)和538-553(藍紅色，胞外殘基554為白色)。(KE,etal.Acta,2021)
至此，長久以來對人紅細胞相關自身抗原的機制、作用意義及對應的特異性靶抗體的猜想和探求，終塵埃落地，有了一個較為明確的理論和經過實驗嚴格驗證的精準的靶向。
"剝開迷霧，找尋真相”
——曾經走過的路
01溫自免溶貧與自身抗原
溫自身免疫性溶血性腎炎(wAIHA)是一種自身免疫性血液癌癥，病人會形成針對自身紅細胞的自身抗原。wAIHA可能是特發性的，沒有任何早已完全明晰的機制，或則是繼發于個別癌癥如慢性淋巴細胞肺癌，或服藥如α-甲基多巴等。近來，wAIHA被報導與檢測點抑制劑療法的使用相關如用于醫治個別惡性腦瘤的抗PD-1。wAIHA的特征是獲得性溶血性胃炎，有時會殃及生命。IgG、補體(C3d/g)或二者的直接抗人球蛋白試驗(DAT)常常呈陰性。病人紅細胞的放散液和血漿富含針對幾乎所有紅細胞的抗原，沒有顯著的特異性。從歷史上看，這種自身抗原可與Rh血型系統有關，由于它們一般不與缺少Rh抗體的罕見紅細胞發生反應；不過，也有關于針對特定紅細胞抗體(如D、Jka、E、Ge、Wr等)的特異性或模擬抗原()的孤立報導，它們雖然又可以類似于同種抗原。(PetzLD,etal.,2004;DoleyGEPB,etal.EurJ,2019.)
另外，在初期使用密度梯度離心進行紅細胞年紀分級，也發覺溫自身抗原可以按照其與含有網織紅細胞或缺少網織紅細胞的不同紅細胞組的反應性進行分類。許多溫自身抗原與含有網織紅細胞的紅細胞組反應不太強烈或根本不反應。這一發覺也促使提出了這種溫自身抗原的血型特異性的問題。(DR,etal.Blood,1984.)
從歷史上看，自身抗原曾被覺得具有多種靶向特異性。初期的許多研究確定，許多這種自身抗原未能與缺少Rh血型抗體的稀有紅細胞發生反應，如等。為此，溫自身抗原最初被覺得與Rh抗體發生反應。但是，多年來關于溫自身抗原額外特異性的其他報導開始出現，包括Jka、Kell、、、血型糖蛋白A以及D和LW抗體。為了更好地了解溫自身抗原的特異性過去曾進行了大量的研究，隨著越來越多的顯著證據出現，突顯了紅細胞上的帶3蛋白與自身抗原特異性密切相關，而且很可能是這種自身抗原的主要目標靶抗體。值得注意的是，血型糖蛋白A和Rh血型抗體等均與帶3蛋白相關細胞膜選擇性通透，抗體也坐落帶3蛋白上。已知紅細胞中Rh抗體的遺失會對紅細胞膜的氫鍵形成影響，造成相關的肝炎。為此，之前使用紅細胞對自身抗原不反應進而推論個別溫自身抗原具有Rh特異性的報導可能正是因為帶3蛋白的改變，由于溫自身抗原辨識的正是帶3的表位，而當帶3表位構型變化時，自身抗原則無法辨識了，但前述給人的印象似乎是自身抗原是指向Rh而不是帶3。(BlochEM,etal.,2020;DR.CurrOpin,2023.)
02帶3蛋白與溫自身抗原
帶3蛋白(Band3，AE1/)是一種跨膜陰離子交換蛋白。它的作用是交換氯化氫鹽和硝酸物，是抒發量最高的紅細胞膜蛋白，它在結構和生理兩方面都起作用。(MJ.MolMembrBiol,1997.)
帶3蛋白相關結構機制及與血型的相關性，請參見本公眾號前期發表的原創文章，鏈接如下：、
帶3蛋白通過其與錨定蛋白和細胞骨架網路的數學聯接為紅細胞提供機械支持。帶3與多種蛋白(包括Rh)以及兩種特定復合物的互相作用有助于細胞形態、組織的保護和維持紅細胞的完整性。帶3的蛋白-蛋白互相作用的任何變化，都可能影響帶3出現個別不同構象狀態的變化，這其中也指向性的啟示了人們對溫自身抗原辨識的紅細胞自身抗體特異性的探察。(KayMM.,1985.)
據悉，帶3蛋白也被覺得是一種可以曝露新抗體的蛋白質，歷史上，該新抗體以前成為了特定意義的衰老紅細胞抗體，因而諸多假定也提出了帶3蛋白與紅細胞衰老密切相關。
在20世紀80年代，曾有兩項互相獨立不同的研究均報告了溫自身抗原與紅細胞年紀相關。兩組均報告稱，wAIHA病人的溫自身抗原活性中很大一部份優先與較陳舊的紅細胞發生反應。發覺與成熟紅細胞相比，從wAIHA病人紅細胞中放散出來的自身抗原中有4/5(80%)左右對含有網織紅細胞的反應較弱。她們曾將這些差別反應性歸結于Rh系統，由于曾發覺網織紅細胞與抗-D的反應性高于成熟紅細胞。后來的研究中，在使用密度梯度來有效分離網織紅細胞與成熟紅細胞后，對24名wAIHA病人進行DAT時發覺，79%的病人網織紅細胞上的IgG比其成熟、較老的紅細胞上的IgG少得多。37%的病人中，網織紅細胞富集部份的DAT呈陽性。研究還發覺，這些反應差別性并非由Rh造成，由于使用正常健康人血液對其網織紅細胞和老年陳舊紅細胞上測量了多種不同的抗Rh系統抗原，發覺反應性沒有差別。近日，有研究使用不連續梯度分離22名wAIHA病人的含有網織紅細胞和老年紅細胞，否認了溫自身抗原的這些特異性。另有研究通過蛋白質印跡和使用LC-MS(氣相色譜質譜聯用儀)的結果表明，溫自身抗原是與紅細胞上的帶3蛋白發生反應。這種結果也說明了，大多數wAIHA病人體內的自身抗原可能代表著正常紅細胞衰老的激化。(GrayLS,etal.BrJ,1983;DR,etal.Blood,1984;DR.CurrOpin,2023.)
毫無疑惑地，也正是對紅細胞衰老進程的研究，逐漸解開了人類紅細胞自身抗原特異性靶向之謎，對自身抗原作用意義、機制的探求也是探索人類紅細胞衰老及清理機制的過程。
03帶3蛋白與衰老紅細胞抗體
由Kay在20世紀80年代早期完成的紅細胞衰老機制的研究提供了第一個假定，即人類紅細胞衰老是因為天然存在的自身抗原引起衰老紅細胞上帶3膜成份的變化。結果表明，自身抗原結合是因為紅細胞的氧化應激所致，假定覺得衰老紅細胞抗體的分子大小在55-65kDa之間，由帶3蛋白的兩部份組成。在帶3的第3個外環上發覺一種肽(肽1，多肽538–554)和第二種肽(肽2，多肽812–830)，它可以步入細胞內和細胞外環境，但是當在細胞外表達時，形成被自身抗原辨識的新抗體。據悉，紅細胞老化和氧化可能通過影響肽2的定位來推動這些新抗體的產生。肽1和肽2對于紅細胞衰老抗體構型的產生都是必需的，這一觀點最初即來自前述Kay的研究工作。(KayMM..1985.)
時隔多年以后，在2021年等借助共聚焦顯微鏡和蛋白質物理方式研究表明肽2在其內部與外部定位中是動態的，而且它在紅細胞膜上的內部和外部位置之間振蕩，即“分子時鐘”理論(本文章引文部份)。她們假定，當兩種肽都可以從外部接觸時，針對該構型抗體的天然自身抗原還會結合，但是因為肽2處于短暫的細胞外部狀態，自身抗原將結合并“保持”該抗體構型，直至積累足夠的自身抗原，再通過激活巨噬細胞上的Fc受體來啟動對衰老紅細胞的吞噬清理。(KE,etal.Acta.2021)
總結前述眾多研究和理論細胞膜選擇性通透，目前早已能確定，紅細胞上的帶3蛋白是wAIHA病人自身抗原的紅細胞特異性靶向抗體。在大概80%的病例中，wAIHA靶點破壞的是較老的紅細胞，研究也表明這種病人的紅細胞比正常人紅細胞衰老得更快。在這80%的病人中，自身抗原辨識帶3蛋白上的衰老紅細胞抗體。進一步假定這些自身抗原的形成和效力因紅細胞衰老抗體的免疫而減緩，紅細胞衰老抗體通過適應性免疫系統加工形成致病性自身抗原。近來的研究推論也支持了原本的假定，即衰老的紅細胞抗體是通過一個動態過程曝露的，其中帶3蛋白二環翻轉到細胞表面因而形成了一個新構型的抗體，即衰老紅細胞抗體，也即自身抗原的紅細胞特異性靶抗體。
主編：鐘靖
我不再將這個世界與我所期盼的，
打造的完滿世界比照，
而是接受這個世界，
愛他，屬于他。
——赫爾曼·黑塞《悉達多》