英文摘要
新型冠狀病毒腦炎大流行在全球范圍內(nèi)引起嚴重的公共衛(wèi)生危機。為防治新型冠狀病毒（acute2，SARS-CoV-2）對健康帶來的不利影響，不同類型、不同生產(chǎn)工藝的SARS-CoV-2卡介苗陸續(xù)被研制，包括減毒活卡介苗、核酸卡介苗、病毒載體卡介苗、滅活卡介苗和重組蛋白卡介苗等，而病毒表面的刺突蛋白是SARS-CoV-2卡介苗的研究熱點。此文主要介紹SARS-CoV-2刺突蛋白的結構、功能與免疫學特點，以及相關SARS-CoV-2卡介苗的研究情況、安全性、適用性等，并討論潛在問題解決舉措。
正文
新型冠狀病毒（acute2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒腦炎（COVID-19）在我國傳染病預防法中被劃入乙類傳染病，采取甲類傳染病的防治舉措。截止2022年3月15日，依據(jù)WHO發(fā)布的相關疫情統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球累計診斷已超過4.5億例，累計死亡超過600萬例。面對這么嚴峻的形勢，各國研究人員推進了研發(fā)SARS-CoV-2卡介苗的腳步。本文就SARS-CoV-2刺突（spike，S）蛋白的結構、功能以及基于S蛋白的SARS-CoV-2卡介苗的安全性和適用性等潛在問題展開綜述。
S蛋白結構、功能及其受體
1.1
S蛋白的結構與功能
SARS-CoV-2的S蛋白為病毒表面的一類標志性跨膜蛋白，是由3個相同的亞基通過非共價鍵的形式結合產(chǎn)生的同源三聚體[1]，其相對分子質(zhì)量為141178，富含1273個多肽[2]。完整的S蛋白由胞外器件、跨膜部份和胞內(nèi)C片斷構成，胞外器件由甲基端的S1和甲基端的S2兩個亞單位構成。其中，球狀的S1負責介導病毒與胞膜受體結合，柄狀的S2負責介導此后的膜融合過程。S蛋白冠部由3個S1亞單位構成，莖部由1個S2亞單位構成[3]。SARS-CoV-2S蛋白的多肽序列與SARS冠狀病毒（SARS，SARS-CoV)的序列有約75%的同源性[4]。SARS-CoV-2和SARS-CoV的S1亞單位序列相像性接近70%，而S2亞單位有接近99%的相像性[5]。
1.2
S蛋白的受體
SARS-CoV-2的細胞受體血管緊張素轉換酶2（-2，ACE2）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性肽。目前覺得，在SARS-CoV-2感染中，ACE2為病毒步入細胞的主要受體。除ACE2外，Ⅱ型跨膜氨酸蛋白酶（typeⅡ，）也在SARS-CoV-2感染細胞時發(fā)揮重要作用，兩者同時在Ⅱ型肺臟細胞中共同抒發(fā)。ACE2作為含鋅羧肽酶的Ⅰ型跨膜蛋白，多抒發(fā)于肝臟、心臟和女性生殖系統(tǒng)，同時也在肺、小腸和腎臟等組織中抒發(fā)[6]，見圖1。
部份COVID-19病人臨床早期的表現(xiàn)諸如腹痛、腹瀉等病癥，可能與ACE2在肝臟的分布有關[7]。ACE2已被證明是SARS-CoV的S蛋白感染肺臟細胞時的主要受體[6]。ACE2有兩類功能：一是作為催化活性的蛋白酶降解血管緊張素Ⅱ；二是作為受體介導SARS-CoV-2的入胞，即ACE2的非蛋白依賴。為此，病毒可通過ACE2的非蛋白依賴功能感染人體，導致ACE2蛋白濃度的降低和功能的衰退[8]，使肺的相關組織出現(xiàn)不同程度的損傷。SARS-CoV-2感染的人ACE2轉基因大鼠具有間質(zhì)性腎炎的典型病理學表現(xiàn)，而感染SARS-CoV-2的野生型大鼠則無上述病癥[9]。另外，SARS-CoV-2易感染抒發(fā)ACE2的細胞，但不易感染未抒發(fā)ACE2的細胞。且等[10]研究表明，ACE2在SARS-CoV-2入胞過程中發(fā)揮的作用難以被酰基肽酶N等跨膜糖蛋白取代。為此，SARS-CoV-2可借助ACE2作為步入細胞的受體。則用于S蛋白的活化過程。在堿性條件下，SARS-CoV-2與Ⅱ型肺臟細胞的結合后可激活S蛋白細胞膜糖蛋白，使其切割質(zhì)膜步入細胞，在推動膜融合以及病毒的入胞過程中發(fā)揮重要作用[11]。SARS-CoV-2通過S蛋白結合、感染細胞后，可使后者粘附并感染健康的細胞，加速病毒傳播[12]。抒發(fā)和ACE2的細胞被SARS-CoV-2感染的風險，比不抒發(fā)和ACE2或只抒發(fā)其三的細胞急劇增強[13-14]。
S蛋白與受體的互相作用
2.1
受體結合域（，RBD)作用下的結合過程
S蛋白主要由訊號肽、N端結構域、RBD、融合肽段、七肽重復序列(，HR)1、HR2、跨膜結構域、胞質(zhì)結構域等構成，同時具有S1/S2與S2′兩個切割位點[5]。S蛋白的多肽次序如圖2所示[17]。相關研究顯示，HR1和HR2會在S1的RBD與靶細胞的ACE2結合后，產(chǎn)生融合核心（6-HB），提升病毒融合和感染的效率[19-20]。
2.2
SARS-CoV-2主要突變位點剖析
自SARS-CoV-2被發(fā)覺以來，全世界范圍內(nèi)已有20多個變異株，截止2022年1月7日，WHO定義了5個關切變異株（of，VOC），即阿爾法(α)、貝塔(β)、伽馬(γ)、德爾塔(δ)和奧密克戎(ο)。
如圖3所示，α變異株RBD中存在1個突變N501Y，提高了S蛋白與受體ACE2的親和力細胞膜糖蛋白，在提升感染力的同時提高自身的免疫逃逸。β變異株存在3個坐落RBD的突變K417N、E484K、N501Y，提示該變異株具有較高的傳播力和感染力，并在一定程度上減少卡介苗的中和活性。γ變異株存在3個坐落RBD的突變K417T、E484K、N501Y，與β變異株相像，可能增加卡介苗的中和活性。δ變異株S蛋白存在8個突變，2個（L452R和T478K）在RBD。ο變異株在RBD上存在15個突變，包括E484A、K417N等與免疫逃逸相關的突變，提示其可能具有很強的耐藥性和免疫逃逸能力。表1列表統(tǒng)計整理了上述5個VOC，并簡略剖析其突變結果。
VOC在RBD的突變呈現(xiàn)遞增趨勢，使得卡介苗的中和活性增長。全球首個ο血漿中和試驗顯示，卡介苗接種者血漿對ο變異株的中和活性僅為原始毒株的1/22[21]。SARS-CoV-2S蛋白的484和417位多肽的突變與免疫逃逸有關，β變異株的E484K、K417N突變，γ變異株的K417T突變都在不同程度上增加了臨床使用的單克隆抗原（單抗）的中和作用，存在相像變異的ο變異株可能對針對該類位點的單抗形成抗藥性。而K417N、Q493R、N501Y、N505H的突變，可能會提高病毒與ACE2的結合能力并降低其感染性[22]。其中，K417N突變可通過推動RBD與ACE2結合的方法促使入胞。而非RBD的突變，如S1/S2Furin蛋白酶裂解位點附近的3個突變H655Y、N679K、P681H，前三者可提升ο變異株的免疫逃逸能力，在增強對單抗的抗性方面起重要作用；P681H突變促使Furin蛋白酶與S蛋白的結合親和力提高，此突變也見于α變異株，可能有利于病毒步入寄主細胞。上述突變造成ο變異株的再感染風險、免疫逃逸風險提升，且提升了重復感染的可能性。
SARS-CoV-2S蛋白卡介苗的研制及應用
3.1
S蛋白相關卡介苗研制現(xiàn)況
目前處于臨床試驗階段的SARS-CoV-2卡介苗為112種，處于臨床前試驗階段的有183種。基于WHO的卡介苗研制數(shù)據(jù)[23]，依據(jù)臨床試驗階段卡介苗相關信息并參考部份文獻[24]，表2列舉了全球步入臨床試驗的基于S蛋白的COVID-19卡介苗。
3.2
S蛋白相關卡介苗使用現(xiàn)況
截止2022年1月7日，有32種SARS-CoV-2卡介苗已上市或獲準緊急使用[25]，其中使用時間較長的6種卡介苗（保護率）分別為：法國賽諾菲/美國公司（95%[26]）、美國公司（94.1%[27]）的mRNA卡介苗，日本牛津學院/諾華公司（70.4%[28]）、美國強生公司（日本72%、拉丁歐洲66%、南非57%[29]）的腺病毒載體卡介苗，上海生物制品研究所有限責任公司、北京科興生物制品有限公司的滅活卡介苗（法國50.65%、土耳其91.25%[30]）。
除上述較常規(guī)的卡介苗，諸多如氣溶膠腺病毒卡介苗、鼻噴卡介苗、口服卡介苗等新型卡介苗正在研制中。
3.3
不同類型的含S蛋白卡介苗相關問題
3.3.1滅活卡介苗滅活卡介苗在疫情早期發(fā)揮了較大的作用，對SARS-CoV-2變異株B.1.429和α變異株仍保持免疫效力，但對其他VOC的療效并不理想，比如β、γ變異株的血漿中和效率明顯增加[31]。
滅活卡介苗相對穩(wěn)定，安全性較高，生產(chǎn)工藝簡單，但接種1針誘導的免疫應答水平較低、時間較短，須多次接種以強化免疫療效，但是通常須要佐劑。同時，滅活卡介苗的安全性應嚴格把關，須重點關注卡介苗制備前的滅活療效。
3.3.2減毒卡介苗日本的MV-014-212和美國血漿研究所/日本公司的COVI-VAC均為鼻內(nèi)接種的減毒卡介苗，Ⅰ期臨床試驗療效良好，未出現(xiàn)不良反應，也沒有檢查到野生型病毒。后者對β變異株有效[32]；前者可對α和β變異株形成穩(wěn)定的血漿中和抗原[33]。
減毒卡介苗能誘導機體形成與自然感染相像的免疫保護作用，與滅活卡介苗相比，免疫原性強、作用時間持久，但保藏氣溫要求較為嚴格，但是病毒可能出現(xiàn)毒性回復等問題。因為減毒卡介苗保留一定毒性，對免疫力低下人群不適用。
3.3.3重組蛋白卡介苗重組S蛋白SARS-CoV-2卡介苗的研制主要針對S1亞基設計。其中，日本公司的亞單位卡介苗NVX-在波蘭的Ⅲ期臨床試驗有效率達89.3%，在法國的Ⅱb期臨床試驗顯示其對變異株501Y.V2的有效率達92.6%[34]；山東智飛龍科馬生物藥業(yè)與中國科大學微生物研究所聯(lián)合研發(fā)的重組RBD蛋白亞單位卡介苗[35]已在吉爾吉斯斯坦上市，成為首個獲準臨床使用的SARS-CoV-2重組亞單位卡介苗。
重組蛋白卡介苗借助基因工程技術在體外抒發(fā)修飾基因，比其他卡介苗純化程度更高，但免疫原性較低，抗體表位未能長久維持。可應用佐劑、顆粒免疫原、納米針、表位重組等技術提升卡介苗的免疫原性[34]。糖基化S蛋白的純化及融合前構象的穩(wěn)定，佐劑、病毒蛋白載體的合理選擇等均是須要關注的問題[36]。抗體的選擇也是須要關注的問題，適合的抗體可以防止何必要的安全問題。另外，還應考慮到抗原持久性，探求持久性不高帶來的接種次數(shù)過多的問題。
3.3.4病毒載體卡介苗上海學院和上海萬泰生物制藥股份有限公司聯(lián)合研發(fā)的復制型病毒載體卡介苗-2019-nCoV-RBD-OPT1，以NS1基因缺位的麻疹病毒為載體，抒發(fā)S基因的RBD序列，并通過鼻內(nèi)噴霧的方式給藥，劑量為注射式卡介苗的1/5，已步入Ⅲ期臨床試驗[37]。非復制型病毒載體卡介苗目前有強生公司卡介苗（人腺病毒26）、軍事醫(yī)學研究院/康希諾生物股份公司的Ad5-nCoV卡介苗（人腺病毒5）、牛津學院/禮來公司卡介苗（黑猩猩腺病毒）等。Ad5-nCoV卡介苗插入S基因優(yōu)化序列，Ⅰ期臨床試驗受試者接種后全部形成抗原，不同劑量組耐受性均較好，無嚴重不良反應[38]。另二者針對變異株的保護水平均有增長[39]。
病毒載體卡介苗通過病毒將目的基因在胞內(nèi)抒發(fā)抗體，免疫過程與自然感染接近，可激活機體的汗液免疫，同時激活低毒的細胞免疫及粘膜免疫，具有安全性高、免疫原性高、作用時間長等優(yōu)點。但特定人群可能曾感染用于載體的病毒，造成對其存在普遍免疫，體內(nèi)還可能存在該載體病毒的中和抗原，致使抗原依賴性提高（-，ADE)，增加卡介苗療效。
3.3.5核苷酸卡介苗核苷酸卡介苗是一種基于DNA或RNA研制的卡介苗，將蛋白的基因直接導出細胞，誘導更快速的免疫應答。
3.3.5.1RNA卡介苗編碼分泌S蛋白三聚體RBD的、編碼全長S蛋白的均為針對SARS-CoV-2的mRNA卡介苗，導致的免疫應答相像，但不良反應發(fā)生率更低，但是老年人接種30μg后7和14d的50%、90%中和抗原幾何平均效價均超過了恢復期血漿組[40]。目前已在俄羅斯緊急授權使用。的以色列大規(guī)模接種呈現(xiàn)了較好的保護療效，全體保護率為95.3%，感染保護率97%，無病癥感染保護率91.5%[41]。另一卡介苗mRNA-1273免疫效力與相像[42]。
RNA卡介苗生產(chǎn)周期較短、設計制備過程較易、研制成本較低，可以通過修改抗體序列較好地應對病毒變異等問題。因為該類卡介苗不與寄主細胞基因組接觸，因而避開了基因整合的風險。但該類卡介苗的運輸儲存條件較為嚴苛，且因為缺少技術積累，體內(nèi)遞送等方面存在一定弱項。
3.3.5.2DNA卡介苗日本藥業(yè)公司與上海艾棣維欣生物技術股份公司聯(lián)合研發(fā)的DNA卡介苗INO-4800為全長S蛋白卡介苗，Ⅰ期臨床試驗未出現(xiàn)嚴重不良反應，接種第2劑后安全性和耐受性良好[43]。INO-4800可以針對SARS-CoV-2VOC形成穩(wěn)定的細胞免疫力，并保持良好的中和抗原和T細胞活性[44]。
DNA卡介苗制備不涉及病毒的復制、基因抒發(fā)，有著較高的安全性。DNA卡介苗可在體內(nèi)常年抒發(fā)，并通過寄主細胞誘發(fā)細胞和汗液免疫，導致更強的免疫保護作用。并且DNA比較穩(wěn)定，可在標準冷凍氣溫（2~8℃）保藏較長時間，在存儲和運輸方面有優(yōu)勢。但引物DNA可能會誘導自身免疫應答，增加卡介苗作用。常年抒發(fā)外源抗體還可能導致機體的免疫耐受，或因抒發(fā)水平較低被中和抗原消除，喪失防治療效。同時，外源DNA有整合入寄主細胞基因組的風險。
3.3.6納米顆粒卡介苗納米顆粒卡介苗可以提供萊西度抗體表位[34]，但是與蛋白亞單位有著相像的結構，能有效激活免疫系統(tǒng)形成良好的免疫應答。目前有5種該類型的COVID-19卡介苗步入Ⅲ期臨床試驗。同時，對刺突蛋白-鐵蛋白納米顆粒（spike，SpFN）卡介苗的研究顯示，該卡介苗可誘導有效的免疫應答，并且可能對SARS-CoV-2變異株以及其他冠狀病毒提供廣泛的保護，SpFN卡介苗單次免疫K18-hACE2大鼠形成的抗原被動免疫大鼠，可抵抗致死劑量病毒功擊，但是低劑量抗原不會降低ADE風險[45]。
納米顆粒卡介苗因不含核苷酸，不能自主復制，故不具有傳染性，并且可通過抗體呈遞平臺改善抗體呈遞的時間，以實現(xiàn)常年免疫，是一類極具借助價值的卡介苗。但該類卡介苗的作用機理較為復雜，也可能導致免疫病理反應，卡介苗的安全性還有待探究。
3.4
卡介苗面臨的挑戰(zhàn)
3.4.1SARS-CoV-2的基因變異在全球COVID-19大流行的背景下，SARS-CoV-2的突變機率大大降低。尤其是在δ毒株變異影響下，卡介苗的免疫效力開始增加[31]。雖然這么，卡介苗的保護效力仍然存在[46]。2021年11月于加拿大出現(xiàn)的ο變異株在RBD上有15處突變，并在P681H和N679K形成有別于其他變異株的突變，可能使其逃逸免疫系統(tǒng)的能力提高。并且該變異株多達30處的變異位點，可能使之在一定程度上逃避T細胞免疫[47]。因而應持續(xù)關注SARS-CoV-2的抗體表位的變化，重點關注S基因的諸位點。而S2亞單位的可變性要大于N端結構域，通過設計針對S2亞單位的單抗可減緩S基因突變帶來的影響。還應關注SARS-CoV-2其他基因的位點改變，關注抗體甩尾情況，以應對可能出現(xiàn)的病毒變異風險，及時作出反應。
3.4.2ADE風險在關于SARS-CoV-2的臨床研究中，有研究者發(fā)覺SARS-CoV-2有ADE的風險[48-49],即抗原可在一定程度上協(xié)助病毒步入靶細胞，增強感染率。SARS-CoV在研究中已被否認有ADE效應[2],其與SARS-CoV-2除了在基因序列上重合度高，但是在卡介苗設計的重點位置S1和S2上也存在很高的同源性[4-5]。雖然劉斌等[50]的研究表明SARS-CoV-2感染導致ADE的風險很小，而且在δ變異毒株中ADE效應卻有所詮釋。為此，在關于SARS-CoV-2的細胞粘附、體內(nèi)傳播等方面應繼續(xù)研究，并在臨床試驗中評估潛在的風險，以最大化地減少可能存在的ADE風險。也可選擇研制多種類型的卡介苗，如核苷酸卡介苗、病毒載體卡介苗等，以應對可能出現(xiàn)的ADE風險。
3.4.3卡介苗保護持久性COVID-19疫情暴發(fā)速率快、時間短，人們對相關卡介苗的免疫持久性研究有限。按照已有臨床觀察，被病毒感染1~2周后，體內(nèi)開始出現(xiàn)病毒抗原，然后抗原水平隨時間進行性下降，直至到達峰值，在峰值效價維持數(shù)周后，開始增長。研究發(fā)覺，復健者體內(nèi)的中和抗原應答持續(xù)時間起碼為7個月[51]。根據(jù)當前的全球疫情態(tài)勢，卡介苗的持續(xù)時間應保持1年左右，以應對疫情中的突發(fā)性應急風波。因為尚不清楚SARS-CoV-2S基因的DNA序列在細胞中的狀態(tài)，以及是否會影響卡介苗的持久性和整合率，研制者在卡介苗研發(fā)過程中，應選定合適類型的卡介苗、選擇適合抒發(fā)抗體基因的載體等，通過各類方法得到療效良好、持久性高的COVID-19卡介苗。
3.4.4卡介苗接種形成的不良反應在相關研究中，卡介苗的不良反應發(fā)生率從高到低為：病毒載體卡介苗、mRNA卡介苗、重組蛋白卡介苗、滅活卡介苗[52]。除卡介苗自身之外，還應考慮佐劑的風險，姜輝等[53]的研究顯示，佐劑可能會導致機體的過敏反應或則免疫逃逸現(xiàn)象。為此，在卡介苗研制過程中，應對卡介苗、佐劑以及適應人群進行嚴格的篩選。如任淑萍等[54]研究證明，采用疫苗作為佐劑可有效提高樹突狀細胞的作用，也可誘生多種免疫活性物質(zhì)，起到良好的免疫保護療效。而且依照等[55]、等[56]的流行病學模型可知，疫苗的接種對于防治SARS-CoV-2有一定作用。而Joyce等[45]發(fā)覺，SpFN與佐劑ALFQ導致的免疫應答一直優(yōu)于碘化鉀佐劑。脂類體類佐劑比ALFQ更易獲取、安全性更高，可能成為未來大規(guī)模使用的一類佐劑。
3.4.5針對特殊人群的使用除高風險地區(qū)人員、醫(yī)護工作者、人口流動較大場所的工作人員外，嬰兒、老年人、兒童、免疫抑制或缺陷人群也屬于高風險人群。諸如，嬰兒感染SARS-CoV-2可造成妊娠期高血糖、早產(chǎn)、產(chǎn)后流血等風險，甚至出現(xiàn)更嚴重的病癥，而大部份的臨床試驗中卻未涉及妊娠期婦女。目前，WHO容許的卡介苗適用年紀為18~60歲，60歲以上老年人不在此范圍內(nèi)，但老年人感染率更高，發(fā)展成危重的概率較年青人也更大[41]。并且在接種卡介苗后，老年人形成的中和抗原效價也比年青人低[57]。針對上述兩種情況，卡介苗研制時一方面應多方位考慮卡介苗的適用人群，或加強非高危人群的接種率，間接保護高危人群；另一方面應在臨床研究中舉辦多層次試驗，以獲得不同年紀、不同性別個體的數(shù)據(jù)，指導卡介苗設計和接種。
展望
目前，COVID-19疫情仍是全球重大的公共衛(wèi)生問題和挑戰(zhàn)，而S蛋白在COVID-19的致病機制及卡介苗的研制過程中發(fā)揮重要作用。隨著對SARS-CoV-2S基因等的進一步研究，SARS-CoV-2對人體的致病過程將得到更深的理解。面對SARS-CoV-2S基因的變種，多價卡介苗及針對免疫力低下的特殊人群卡介苗的研制亟不可待。今后，我們還需進一步強化對SARS-CoV-2及其卡介苗的研究，為COVID-19的防治和醫(yī)治奠定基礎。
引用本文：范立丁，于美美，崔晏碩，等.新型冠狀病毒刺突蛋白結構及其卡介苗研制[J].國際生物制品學刊物,2022,45(2):61-69.
《國際生物制品學刊物》為中華醫(yī)學會系列刊物，出刊于1978年10月，目前由中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會主管、中華醫(yī)學會和北京生物制品研究所有限責任公司承辦。歷任主編李秀玲，編委團隊共75人，審稿專家101人。
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