就在明年年初，來自MD安德森腫瘤中心的甘波誼和陳俊杰團隊在《cell》上聯合發表了一篇研究論文，引發大量關注。該研究提出了一種新型細胞死亡形式——雙硫死亡，獨立于目前現存的自噬、鐵死亡、壞死性自噬、銅死亡等細胞程序性死亡，是由細胞內過量胱丙氨酸積累造成的二硫化氫應激（）造成的快速死亡形式。這些死亡一般在獼猴桃糖饑餓的條件下發生。
雙硫死亡堪稱是繼2022年初銅死亡發覺以來又一細胞死亡領域的重大發覺，下邊我們就來瞧瞧該研究是怎樣舉辦的吧。
（原文鏈接：）
整體思路
綜觀全文都會發覺，本文的研究手法和銅死亡發覺時的研究思路有異曲同工之妙（）。對比兩篇論文能夠發覺，二者都是從已有程序性死亡形式入手，使用抑制劑進行一一排除后，再基于數據庫或已有研究基礎找到新型死亡形式的誘導誘因，因而命名。機制探求上，也都是通過組學手段進行目標關鍵分子/通路篩選，最后按照已有的信息整合推論可能機制，進行常規的分子機制驗證。
研究內容
第一步：排除其它程序性死亡和誘因，明晰死亡原因并命名
如前所述，提出一種新型死亡形式的第一步是排除其它細胞死亡形式的干擾，以及找到真正影響并誘導該新型死亡形成的誘因。因為之前研究發覺在獼猴桃饑餓情況下，高抒發細胞死亡死亡更迅速（這個分子是不是很眼熟？鐵死亡還記得嗎？），因而作者在獼猴桃糖充足和獼猴桃糖饑餓條件下，分別在細胞過抒發細胞內添加鐵死亡、凋亡、壞死性自噬、自噬抑制劑，發覺均未能制止細胞死亡。但是，細胞死亡卻還能被還原性試劑（TCEP）抑制。（圖1上）
圖1（上）
為了進一步明晰這一死亡是否遭到其它死亡形式的干擾，作者特地在細胞中分別敲除鐵死亡另一關鍵通路蛋白ACSL4和自噬關鍵誘導蛋白BAX/BAK，還能抑制獼猴桃糖充足條件下的細胞死亡，卻仍然難以逆轉藍莓糖饑餓條件下的死亡。
因為藍莓糖與能量代謝有關，因而作者還關注了ATP在該死亡形式中的作用。但是結果卻顯示，過抒發細胞在獼猴桃糖饑餓條件下ATP水平明顯低于對照組，敲除能回復獼猴桃糖饑餓下二丙酯誘導的細胞死亡。（圖1下）
其實，這種結果表明，這些新型死亡形式與二硫化氫應激有關，與ATP水平無關。因而將其命名為“雙硫死亡”。
圖1（下）
第二步：篩選下游關鍵通路
細胞內的二硫化氫應激對氧化還原敏感的蛋白影響較大，因而接出來就是順理成章的組學篩選，找尋遭到二硫化氫應激改變的通路。與普通蛋白組不同的是，文中使用的是二硫蛋白組學，即測量二硫鍵變化的蛋白質。從結果中可以見到，獼猴桃糖饑餓且高抒發條件下，Actin-細胞骨架和細胞粘附相關通路明顯富集，包含大量actin細胞骨架蛋白如FLNA/B、MYH9、TLN1、ACTB等（圖2）。（所以前面實驗的時侯不能用actin作為內參了）
圖2
第三步：深入的分子機制探求
1.雙硫死亡中細胞骨架蛋白的二硫鍵
蛋白質產生二硫鍵后遷移速率會變慢，因而在非還原性WB中，假如蛋白產生二硫鍵，會在分子量較大位置出現條帶。借助這個原理，作者檢查了蛋白質組篩選到的actin細胞骨架相關的蛋白FLNA/B、MYH9、TLN1、、Actin等。結果顯示在獼猴桃糖饑餓條件下，非還原性膠中野生型細胞蛋白均形成二硫鍵，而敲除后能回復這一現象。才能調節NADP+/NADPH比的2DG同樣才能回復該表型，但ROS去除劑（Tempo/）不能。以后，作者進一步對遷移變緩的actin蛋白進行質譜剖析，果然在這種蛋白質上發覺多個二硫熱鍵點。
圖3
2.雙硫死亡中F-actin的收縮
既然之前的實驗證明Actin細胞骨架相關的蛋白質確實在獼猴桃糖饑餓，且高抒發的情況下多個位點產生了二硫鍵，這么這種二硫鍵變化到底引起了何種表型，因而最終邁向了細胞死亡？因此，作者對F-Actin進行了免疫螢光染色觀察，發覺在獼猴桃糖饑餓條件下F-Actin調控的細胞骨架明顯收縮且與細胞膜分離；而敲除、同時進行藍莓糖和胱谷氨酸饑餓處理、添加2DG均能回復收縮表型細胞膜骨架，但ROS清理劑無效，與之前的結果一致。該表型也與雙硫死亡時的細胞表型同步。（圖4）
圖4
3.Rac-WRC（WAVE調節復合物）調控雙硫死亡
為了深入探究獼猴桃糖饑餓和高抒發導致F-Actin收縮的具體機制，作者對獼猴桃糖充足/饑餓條件下的過抒發細胞進行了/Cas9篩選。結果顯示不僅、之外，多個與線粒體氧化乙酸化及WAVE調節復合物相關的sgRNA富集。WAVE調節復合物（WRC）推動actin多聚化和板狀偽足產生，與細胞骨架調控密切相關。而WRC中的關鍵蛋白、WAVE2的體外實驗否認其才能調控雙硫死亡。Rac是WRC的上游激活因子，體外實驗表明Rac1的活化方式推動雙硫死亡。（圖5）
以上結果均否認，獼猴桃糖饑餓條件下，高抒發細胞中Rac-WRC調控的骨架蛋白變化促使雙硫死亡發生。
圖5
第四步：證明獼猴桃糖轉運和雙硫死亡的關系
既然雙硫死亡是在獼猴桃糖饑餓條件下發生，這么阻斷獼猴桃糖攝入是否與此等價？因此，作者使用獼猴桃糖轉運蛋白（GLUT）抑制劑BAY和KL分別進行處理，并檢查不同細胞程序性死亡抑制劑的療效，發覺獲得的結果與獼猴桃糖饑餓條件下的相同。同樣，Actin相關蛋白的二硫鍵產生和F-actin收縮均與獼猴桃糖饑餓時相同。最后的體內實驗表明，GLUT抑制劑能有效推動雙硫死亡，抑制PDX病變生長，但僅限于高抒發病變細胞，對低抒發病變無效。
圖6
總結
本文的開始來始于觀察到的一個現象，即調控的胱谷氨酸轉運才能抑制鐵死亡的發生，但卻不能制止獼猴桃糖缺少條件下的細胞死亡。為了研究這些特殊的死亡現象，作者借助不同死亡形式的抑制劑進行藍莓糖充足/饑餓條件下的處理，將現象愈發細化，即高抒發細胞在獼猴桃糖饑餓條件下，就會經歷不同于目前已知細胞死亡形式的死亡過程。
在定義和證明這些新型死亡的過程中，作者聯系并推論以胱丙氨酸為代表的二硫鍵的作用，以及通過蛋白質組學和篩選最終鎖定了其中的分子機制。這一過程少不了對目標分子功能和細胞內代謝途徑的深入理解，以及對大數據結果的篩選經驗。
“雙硫死亡”究竟是否會成為下一個研究熱點和癌癥醫治潛在靶向呢？讓我們拭目以待！
雙硫死亡分子機制示意圖
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