單位：四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院檢驗(yàn)科
在臨床微生物檢測(cè)中，我們經(jīng)常需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法有很多種，不同的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法采用的計(jì)數(shù)單位也不同。我們常見的細(xì)菌計(jì)數(shù)單位有/ml、mcf、cfu/ml、ccu/ml。這些計(jì)數(shù)單位的含義以及所采用的計(jì)數(shù)方法，你都了解嗎？
1.件/毫升
個(gè)/毫升是指每毫升標(biāo)本中所含細(xì)菌的數(shù)量，以個(gè)/毫升作為細(xì)菌計(jì)數(shù)單位的細(xì)菌計(jì)數(shù)法為計(jì)數(shù)器法。
1.1細(xì)菌計(jì)數(shù)板：細(xì)菌計(jì)數(shù)板與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的原理及組成相同，只不過細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以用油鏡觀察；而血細(xì)胞計(jì)數(shù)板較厚，不能用油鏡觀察，且計(jì)數(shù)板底部的細(xì)菌難以看清[1]。
取一定體積的樣品菌懸液置于細(xì)菌計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)池的體積是一定的（0.02mm3），所以可根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度的細(xì)菌數(shù)計(jì)算出樣品中的細(xì)菌數(shù)。此法簡(jiǎn)便易行，可立即得到結(jié)果。大的酵母菌或霉菌孢子也可使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
1.2 電子計(jì)數(shù)器：電子計(jì)數(shù)器的工作原理與血細(xì)胞分析儀相似，測(cè)量小孔中液體電阻的變化。小孔只能通過一個(gè)細(xì)菌。當(dāng)一個(gè)細(xì)菌通過這個(gè)小孔時(shí)，電阻會(huì)顯著增加，形成脈沖，并自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上[2]。這種方法測(cè)量結(jié)果更準(zhǔn)確，但它只識(shí)別顆粒的大小，無法區(qū)分是否是細(xì)菌。因此，要求細(xì)菌懸液中不含碎屑。
2.mcf
mcf為麥克法蘭濁度單位。人們發(fā)明了用于微生物濁度測(cè)定的不同濁度的標(biāo)準(zhǔn)濁度管，具體配制方法根據(jù)硫酸與氯化鋇的配比決定，見表[3]。當(dāng)0.5 ml氯化鋇（1.17%）加入99.5 ml硫酸（1%）中時(shí)，所得溶液的濁度為0.5麥克法蘭單位。0.5麥克法蘭濃度??菌液是臨床微生物藥敏試驗(yàn)中常用的濃度，一般認(rèn)為，將配制好的菌液濃度配制成0.5麥克法蘭濁度管時(shí)，相當(dāng)于1.5×108個(gè)細(xì)菌/ml。以mcf為細(xì)菌計(jì)數(shù)單位的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法即為比濁法。
2.1 麥克法蘭比濁管：可自行配制麥克法蘭比濁管，也可購(gòu)買市售標(biāo)準(zhǔn)麥克法蘭比濁管，將配制的菌懸液與0.5麥克法蘭濁度的標(biāo)準(zhǔn)麥克法蘭比濁管進(jìn)行比較ml是什么，若濁度相同，則說明菌懸液濃度為0.5麥克法蘭。此方法用肉眼觀察濁度，誤差較大。
2.2 麥克法蘭濁度儀：麥克法蘭濁度儀是采用麥克法蘭濁度法測(cè)定的自動(dòng)化分析儀器，憑借其靈敏、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸取代手工法，成為細(xì)菌濁度測(cè)定的主要工具。麥克法蘭濁度儀測(cè)量細(xì)菌溶液樣品，直接顯示麥克法蘭單位濁度值。根據(jù)國(guó)際通用的麥克法蘭單位濁度值與細(xì)菌數(shù)的關(guān)系，可計(jì)算出細(xì)菌濃度[4]。濁度法簡(jiǎn)便、快速，但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液，并得到細(xì)菌的相對(duì)數(shù)，不能用于測(cè)量顏色過深的樣品。
2.3 分光光度計(jì)：一般實(shí)驗(yàn)室都有分光光度計(jì)，可以測(cè)量細(xì)菌懸液的濁度。按照美國(guó)CLSI（原NCCLS）推薦的方法，將細(xì)菌懸液調(diào)節(jié)到OD（625）值在0.08~0.13之間，相當(dāng)于濁度為0.5[5]。但由于不同細(xì)菌的折射率不同，這只是一個(gè)粗略的換算關(guān)系，只具有一定的參考價(jià)值。
使用麥克法蘭濁度計(jì)和分光光度計(jì)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、可連續(xù)測(cè)量，適合自動(dòng)化檢測(cè)。但由于光密度或透光率受細(xì)菌濃度以外的因素影響，例如細(xì)菌細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分和所用光的波長(zhǎng)，因此濁度法僅是一種相對(duì)粗略的測(cè)量細(xì)菌總數(shù)的方法。
3.菌落形成單位/毫升
CFU即菌落形成單位，是指單個(gè)細(xì)菌或多個(gè)細(xì)菌聚集成簇，在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖所形成的菌落，稱為菌落形成單位，是計(jì)算細(xì)菌或真菌數(shù)量的單位[6]。CFU/mL是指每毫升樣品中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落形成單位的計(jì)數(shù)方法與前面兩種計(jì)數(shù)方法不同，前面兩種方法既計(jì)算活菌，也計(jì)算死菌，而CFU只計(jì)算活菌。以CFU/mL為細(xì)菌計(jì)數(shù)單位的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法是平板菌落計(jì)數(shù)法（CFU法）。
平板菌落計(jì)數(shù)法：取一定體積的菌懸液，做若干個(gè)不同的10倍遞增稀釋度，然后從每個(gè)稀釋度中取1ml置于無菌平皿中，與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間（一般為48小時(shí)）后，記錄每皿形成的菌落數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每毫升原始樣本中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)[7]。此法靈敏度高，是臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)中最常用的活菌計(jì)數(shù)方法。
4. 立方厘米/毫升
CCU是顏色變化單位，是根據(jù)培養(yǎng)基中微生物的代謝活動(dòng)和培養(yǎng)基顏色的變化來計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中微生物數(shù)量的單位[8]。以CCU/ml為細(xì)菌計(jì)數(shù)單位的細(xì)菌計(jì)數(shù)法稱為CCU法。
CCU法通常用于一般比濁法無法計(jì)數(shù)的極微小的微生物ml是什么，如支原體。由于支原體的液體培養(yǎng)物完全透明，呈現(xiàn)清澈透明的紅色，所以不能用比濁法計(jì)數(shù)。由于支原體固體培養(yǎng)困難，不易用CFU法計(jì)數(shù)，所以需要采用特殊的計(jì)數(shù)方法，即CCU法。
下面以解脲支原體為例，簡(jiǎn)單介紹一下操作過程[9]：
1. 取12支無菌試管，每支試管裝入1.8毫升解脲支原體培養(yǎng)基。
2. 在第一管中加入0.2 ml解脲支原體溶液，充分混勻，再吸取0.2 ml于第二管中，依此類推，做10倍梯度稀釋，直至最后一管。
3、37℃培養(yǎng)，取最后一管培養(yǎng)基變色，即為受試菌液的CCU，即支原體的最大代謝活性，如第六管變色，則其相對(duì)濃度為10的6次方CCU/ml，即10^6CCU/ml。
一般來說，比濁法和菌落計(jì)數(shù)法對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù)都可以滿足要求，但對(duì)于支原體等比較特殊的微生物，CCU法更為合適。
臨床細(xì)菌計(jì)數(shù)方法有很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，并不是所有方法都適用。臨床微生物檢測(cè)中，常用的是平板菌落計(jì)數(shù)法和比濁法。至于哪種方法更適合您，則取決于您的具體情況和檢測(cè)目的。
【參考】
[1] 韓翠翠. 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法與稀釋板法分析[J]. 實(shí)驗(yàn)教學(xué)與儀器, 2016, 33(01): 32-34.
[2] 鄭萬強(qiáng). 細(xì)菌培養(yǎng)新進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生, 2009, 47(30): 6-7+29.
[3] 張彩萍. 分枝桿菌Hsp65基因PCR-RFLP三種凝膠電泳方法的比較研究及臨床應(yīng)用[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2009.
[4] 萬濤.基于麥克法蘭比濁法原理的細(xì)菌濁度儀校準(zhǔn)方法探討[J].計(jì)量測(cè)試技術(shù)，2018,45(07):117-119.
[5] 余柏增. 5種碳青霉烯酶基因多重PCR技術(shù)的建立及臨床應(yīng)用[D]. 南方醫(yī)科大學(xué)，2020.
[6] 葛婷婷. 肝膿腫DWI改變及其與大腸桿菌相關(guān)性研究[D]. 上海交通大學(xué), 2017.
[7] 徐雷瑞, 付普博, 王琪, 李丹, 馬丹, 陶文靜, 曲連海, 賈晨, 曾靜. 試紙條法在食品中菌落總數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 食品安全質(zhì)量學(xué)報(bào), 2021, 12(02): 472-478.
[8]王玉梅,李二華,曾凌峰,劉燕,高尚先. 人脲原體核酸檢測(cè)試劑盒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2014, 27(08): 1042-1047.
[9] 鄭秉杰. BALB/c小鼠生殖道支原體流行病學(xué)研究及下生殖道感染模型的建立[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2014.