單位：四川大學華西公共衛生學院/四川大學華西第四醫院檢驗科
在臨床微生物檢測中，我們經常需要對細菌進行計數。細菌數量的測定方法有很多種，不同的細菌計數方法采用的計數單位也不同。我們常見的細菌計數單位有/ml、mcf、cfu/ml、ccu/ml。這些計數單位的含義以及所采用的計數方法，你都了解嗎？
1.件/毫升
個/毫升是指每毫升標本中所含細菌的數量，以個/毫升作為細菌計數單位的細菌計數法為計數器法。
1.1細菌計數板：細菌計數板與血細胞計數板的原理及組成相同，只不過細菌計數板較薄，可以用油鏡觀察；而血細胞計數板較厚，不能用油鏡觀察，且計數板底部的細菌難以看清[1]。
取一定體積的樣品菌懸液置于細菌計數板的計數池中，在顯微鏡下觀察計數。由于計數池的體積是一定的（0.02mm3），所以可根據計數器刻度的細菌數計算出樣品中的細菌數。此法簡便易行，可立即得到結果。大的酵母菌或霉菌孢子也可使用血球計數板進行計數。
1.2 電子計數器：電子計數器的工作原理與血細胞分析儀相似，測量小孔中液體電阻的變化。小孔只能通過一個細菌。當一個細菌通過這個小孔時，電阻會顯著增加，形成脈沖，并自動記錄在電子記錄裝置上[2]。這種方法測量結果更準確，但它只識別顆粒的大小，無法區分是否是細菌。因此，要求細菌懸液中不含碎屑。
2.mcf
mcf為麥克法蘭濁度單位。人們發明了用于微生物濁度測定的不同濁度的標準濁度管，具體配制方法根據硫酸與氯化鋇的配比決定，見表[3]。當0.5 ml氯化鋇（1.17%）加入99.5 ml硫酸（1%）中時，所得溶液的濁度為0.5麥克法蘭單位。0.5麥克法蘭濃度??菌液是臨床微生物藥敏試驗中常用的濃度，一般認為，將配制好的菌液濃度配制成0.5麥克法蘭濁度管時，相當于1.5×108個細菌/ml。以mcf為細菌計數單位的細菌計數方法即為比濁法。
2.1 麥克法蘭比濁管：可自行配制麥克法蘭比濁管，也可購買市售標準麥克法蘭比濁管，將配制的菌懸液與0.5麥克法蘭濁度的標準麥克法蘭比濁管進行比較ml是什么，若濁度相同，則說明菌懸液濃度為0.5麥克法蘭。此方法用肉眼觀察濁度，誤差較大。
2.2 麥克法蘭濁度儀：麥克法蘭濁度儀是采用麥克法蘭濁度法測定的自動化分析儀器，憑借其靈敏、準確、快速等優點，已逐漸取代手工法，成為細菌濁度測定的主要工具。麥克法蘭濁度儀測量細菌溶液樣品，直接顯示麥克法蘭單位濁度值。根據國際通用的麥克法蘭單位濁度值與細菌數的關系，可計算出細菌濃度[4]。濁度法簡便、快速，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，并得到細菌的相對數，不能用于測量顏色過深的樣品。
2.3 分光光度計：一般實驗室都有分光光度計，可以測量細菌懸液的濁度。按照美國CLSI（原NCCLS）推薦的方法，將細菌懸液調節到OD（625）值在0.08~0.13之間，相當于濁度為0.5[5]。但由于不同細菌的折射率不同，這只是一個粗略的換算關系，只具有一定的參考價值。
使用麥克法蘭濁度計和分光光度計進行細菌計數的優點是簡單、快速、可連續測量，適合自動化檢測。但由于光密度或透光率受細菌濃度以外的因素影響，例如細菌細胞大小、形態、培養液成分和所用光的波長，因此濁度法僅是一種相對粗略的測量細菌總數的方法。
3.菌落形成單位/毫升
CFU即菌落形成單位，是指單個細菌或多個細菌聚集成簇，在固體培養基上生長繁殖所形成的菌落，稱為菌落形成單位，是計算細菌或真菌數量的單位[6]。CFU/mL是指每毫升樣品中所含的細菌菌落總數。菌落形成單位的計數方法與前面兩種計數方法不同，前面兩種方法既計算活菌，也計算死菌，而CFU只計算活菌。以CFU/mL為細菌計數單位的細菌計數方法是平板菌落計數法（CFU法）。
平板菌落計數法：取一定體積的菌懸液，做若干個不同的10倍遞增稀釋度，然后從每個稀釋度中取1ml置于無菌平皿中，與營養瓊脂培養基混合，在一定溫度下培養一定時間（一般為48小時）后，記錄每皿形成的菌落數。根據稀釋倍數，計算出每毫升原始樣本中所含的細菌菌落總數[7]。此法靈敏度高，是臨床微生物學檢驗中最常用的活菌計數方法。
4. 立方厘米/毫升
CCU是顏色變化單位，是根據培養基中微生物的代謝活動和培養基顏色的變化來計數培養基中微生物數量的單位[8]。以CCU/ml為細菌計數單位的細菌計數法稱為CCU法。
CCU法通常用于一般比濁法無法計數的極微小的微生物ml是什么，如支原體。由于支原體的液體培養物完全透明，呈現清澈透明的紅色，所以不能用比濁法計數。由于支原體固體培養困難，不易用CFU法計數，所以需要采用特殊的計數方法，即CCU法。
下面以解脲支原體為例，簡單介紹一下操作過程[9]：
1. 取12支無菌試管，每支試管裝入1.8毫升解脲支原體培養基。
2. 在第一管中加入0.2 ml解脲支原體溶液，充分混勻，再吸取0.2 ml于第二管中，依此類推，做10倍梯度稀釋，直至最后一管。
3、37℃培養，取最后一管培養基變色，即為受試菌液的CCU，即支原體的最大代謝活性，如第六管變色，則其相對濃度為10的6次方CCU/ml，即10^6CCU/ml。
一般來說，比濁法和菌落計數法對于大多數細菌的計數都可以滿足要求，但對于支原體等比較特殊的微生物，CCU法更為合適。
臨床細菌計數方法有很多，各有優缺點，并不是所有方法都適用。臨床微生物檢測中，常用的是平板菌落計數法和比濁法。至于哪種方法更適合您，則取決于您的具體情況和檢測目的。
【參考】
[1] 韓翠翠. 顯微鏡直接計數法與稀釋板法分析[J]. 實驗教學與儀器, 2016, 33(01): 32-34.
[2] 鄭萬強. 細菌培養新進展[J]. 中國現代醫生, 2009, 47(30): 6-7+29.
[3] 張彩萍. 分枝桿菌Hsp65基因PCR-RFLP三種凝膠電泳方法的比較研究及臨床應用[D]. 北京協和醫學院, 2009.
[4] 萬濤.基于麥克法蘭比濁法原理的細菌濁度儀校準方法探討[J].計量測試技術，2018,45(07):117-119.
[5] 余柏增. 5種碳青霉烯酶基因多重PCR技術的建立及臨床應用[D]. 南方醫科大學，2020.
[6] 葛婷婷. 肝膿腫DWI改變及其與大腸桿菌相關性研究[D]. 上海交通大學, 2017.
[7] 徐雷瑞, 付普博, 王琪, 李丹, 馬丹, 陶文靜, 曲連海, 賈晨, 曾靜. 試紙條法在食品中菌落總數檢測中的應用[J]. 食品安全質量學報, 2021, 12(02): 472-478.
[8]王玉梅,李二華,曾凌峰,劉燕,高尚先. 人脲原體核酸檢測試劑盒國家標準物質的研制[J]. 中國生物制品學雜志, 2014, 27(08): 1042-1047.
[9] 鄭秉杰. BALB/c小鼠生殖道支原體流行病學研究及下生殖道感染模型的建立[D]. 北京協和醫學院, 2014.