一文盤點常見ADC脫靶毒性有什么？其發生機制怎樣？有什么影響誘因？通過什么優化舉措可以加以改善？
抗原抗生素偶聯物(ADC)是近些年來癌癥領域極具前景的一種新型根治方法，ADC平臺的概念是通過將細胞毒性抗生素選擇性地遞送至癌癥細胞，但是限制曝露于健康的正常細胞，進而降低細胞毒性抗生素的醫治指數。雖然ADC相比傳統放療的靶點性大大提高，而且也不可防止報告正常細胞/組織中的劑量限制性毒性(DLT)。目前，DLT一直是ADC開發的關鍵挑戰。ADC在正常細胞/組織中的毒性機制尚不清楚，但覺得大多數DLT與靶向無關。不僅聯接子-抗生素不穩定性引起循環中細胞毒性抗生素（有效荷載）過早釋放外，受體依賴性（FcγR、FcRn和C型凝集素受體）和受體非依賴性（非特異性內吞）機制攝入/轉運ADC可能造成正常細胞的脫靶毒性。發表在《Ther》上的一篇綜述[1]，回顧了正常細胞中ADC非靶向依賴性攝入和毒性的潛在機制，并討論了可能影響這種機制的潛在誘因。相關內容能為愈發深入地了解ADC脫靶毒性的潛在機制提供根據，有助于開發規避這種機制的方式，從而改善下一代ADC的總體醫治指數。現將該綜述中有關聯接子-抗生素不穩定性、非特異性內吞作用的相關內容梳理如下，以饗讀者。
ADC抗生素非靶向依賴性攝入和毒性的機制
雖然ADC毒性被覺得主要來始于有效荷載，但非靶點正常細胞攝入ADC，并釋放出有效荷載因而形成毒性的相死機制尚不清楚。這些攝入可通過多種機制發生，目前正在進行相關研究來了解這種機制并優化ADC的三種關鍵組分（即單克隆抗原、連接子和有效荷載）。按照大多數恐怕值，ADC在人體靶（病變）部位僅發生適度的積聚（每克病變約0.1%的給藥劑量）。為此，ADC的主要部份保留在循環中或分布到正常組織中，可能被攝入和分解代謝，造成正常細胞毒性。靶向依賴性和非依賴性攝入機制均可能導致正常細胞的ADC攝入和毒性。本綜述將重點關注正常細胞對ADC非靶向依賴性攝入（亦稱為非特異性攝入）及其可能造成的脫靶毒性的機制等相關內容。
表1.ADC中使用的不同類別有效荷載的詳盡信息和臨床研究中一般報告的主要毒性
聯接子-抗生素不穩定性
聯接子-抗生素不穩定性可造成有效荷載過早釋放到血液中，并造成ADC的脫靶毒性。聯接子的選擇是ADC穩定性背后的主要驅動誘因之一。第一代ADC抗生素采用酸可裂解聯接子（比如，腙），其被設計為在血清中性pH環境中穩定，但ADC內化后能在溶酶體內較低pH條件下釋放。
但是，這種初期ADC常常遭到血清穩定性差的困惑，進而造成循環中有效荷載的開裂（圖1）。造成ADC血清不穩定性的誘因包括對血漿蛋白酶的敏感性，尤其是基于肽的聯接子和自發去偶聯，如逆轉錄酶-馬來酰吡啶轉移到血清蛋白上存在的游離胺類上。除安全性問題外，不穩定ADC的效果也可能增加，由于抵達病變的ADC不再完整偶聯有效荷載。在個別情況下，引入不可裂解聯接子可減輕聯接子裂解問題。比較具有可裂解聯接子（SPP-DM1和mc-VC-PAB-MMAE）和不可裂解聯接子（mcc-DM1和mc-MMAF）類型ADC的結果顯示，對于特定靶標(CD22)，具有不可裂解聯接子的ADC的毒性（腎臟和血液學毒性）減少。同樣，與富含可裂解二硫鍵的美登素類ADC相比，含不可裂解硫醇MCC聯接子的ADC，其臨床前安全性特點得到改善。采用不可裂解聯接子ADC的毒性減少被覺得是因為步入體循環的游離細胞毒性有效荷載釋放降低。但是，并非所有靶抗體均適用于含不可裂解聯接子的ADC的醫治，由于須要將完整的mAb分解代謝能夠釋放聯接抗生素以發揮抗病變作用。
圖1.正常細胞攝入ADC或游離有效荷載的潛在機制。靶抗體可能在正常細胞上抒發，并有助于ADC的靶向依賴性攝入。據悉，結合IgG抗原Fc保守區的其他受體，如Fcγ受體(FcγR)、新生兒Fc受體(FcRn)和C型凝集素受體(CLR)也可能有助于正常細胞中ADC的非靶向依賴性內化/轉運。非特異性內吞機制，如巨胞飲或小胞飲也可能造成完整ADC或游離有效荷載內化（因為聯接子-抗生素不穩定或胞外蛋白酶活性在細胞外釋放）。游離有效荷載也可能通過其他機制步入正常細胞，如被動擴散（假如具有膜滲透性）、非特異性內吞或特異性轉運蛋白（假如膜轉運蛋白的底物）介導的攝入。據悉，抗體陰性靶細胞還能否通過將有效荷載釋放到局部環境中介導毒性，隨即被抗體陽性正常細胞（旁觀者效應）通過被動擴散、轉運蛋白介導的攝入或通過其他非特異性內吞機制攝入。
含可裂解聯接子的ADC也可能通過旁觀者效應降低效果，是針對拷貝數較低、腫瘤抒發異質性或內化率較低的癌癥細胞靶抗體的首選。為此，聯接子-抗生素穩定性一直是未來ADC研制優化的關鍵領域，致力最大限度地增強獲得成功的ADC的機率。對于作用強效和具有膜滲透性的細胞毒素，如吡啶苯二氮卓類(PBD)，關注含這種有效荷載的ADC的穩定性尤其重要。據悉，不僅聯接子的可裂解性，釋放有效荷載的膜滲透性同樣可能影響正常細胞中潛在的脫靶細胞毒性，因而影響ADC的醫治指數。
結合位點也可能調節ADC的穩定性和藥代動力學。使用表面曝露的多肽（如賴谷氨酸或半胱谷氨酸）的傳統非特異性偶聯方式會形成高度異質性的ADC（抗生素-抗原比[DAR]，0-8），進而造成ADC的集聚機會降低，但是其整體血清穩定性也會增加。因而，這種采用非特異性結合位點的ADC也可能造成正常細胞中非靶向依賴性攝入和毒性降低的安全性挑戰。近些年來，先進的聯接子技術和對結合位點認識的提升形成了更多的均一性高的ADC，同時改善了總體聯接子-抗生素的穩定性并降低了血清中細胞毒性有效荷載的過早開裂。那些具有更高聯接子-抗生素穩定性的ADC也可以發生更多由靶向驅動的有效荷載釋放，進而提升效果。為此，各類偶聯位點工程策略，包括使用特定多肽（天然或工程）、Fc聚糖和短肽標簽的幾種特異性位點偶聯，已被用于生成具有改善安全性特點的DAR均質性ADC。
比如，采用首個特異性位點偶聯技術--（未配對半胱谷氨酸介導的偶聯）偶聯技術的ADC，其在臨床前的耐受性相對優于具有相同有效荷載和非特異性偶聯技術的傳統ADC。據悉，在臨床前研究中，由半胱谷氨酸工程抗原和PBD（使用新型起火二硫鍵聯接子）組成的ADC顯示出改善的安全性特點（減少毒性），且效果相當，表明其可潛在降低ADC的醫治指數。
1.1與聯接子-抗生素不穩定性相關的ADC毒性
中性粒細胞降低癥（中性粒細胞計數減少）是ADC的一種重要的非靶向依賴性DLT，因為血清中可裂解聯接子不穩定，造成膜滲透性游離有效荷載提早釋放。中性粒細胞降低是許多通過蛋白酶可裂解的纈氨酸-瓜谷氨酸（VC）聯接子與MMAE結合而成的ADC的常見毒性，如、ASG-5ME、、、和PSMAADC。Zhao等人[2]近來進行的一項體外機制研究表明，基于VC-MMAE的ADC誘導的中性粒細胞降低癥是因為釋放的有效荷載對骨髓中分化的中性粒細胞的直接細胞毒性作用所致。按照聯接子物理，VC聯接子預期在溶酶體中發生細胞內半胱谷氨酸蛋白酶介導的裂解。Zhao等人[2]的研究結果闡明，在骨髓微環境中局部分化的中性粒細胞分泌的谷氨酸蛋白酶有助于VC聯接子在細胞外的切割，并釋放膜滲透性MMAE造成對骨髓中分化的中性粒細胞的細胞毒性。但是，這項研究的結果提出了另一個問題，即為何在骨髓細胞外釋放的膜滲透性MMAE有效荷載僅對分化的中性粒細胞（髓系細胞）有毒性，而對骨髓中的其他多種敏感細胞類型如造血干/祖細胞、紅系和巨核細胞系細胞沒有毒性，因此這須要進一步研究論證，非常是使用體內模型比較基于可裂解和不可裂解聯接子-MMAE的ADC的血液毒性（非常是分化骨髓細胞的毒性），以明晰了解和否認細胞外氨酸蛋白酶在中性粒細胞降低癥中的作用。
同樣，周圍神經腫瘤（PN，周圍神經損傷的結果）是另一種與微管抑制劑ADC（不考慮靶抗體）相關、導致醫治終止和/或劑量增加的重要非靶向依賴性臨床毒性。PN被覺得是由聯接子-抗生素不穩定性驅動，因而造成體循環中膜滲透性游離有效荷載（微管抑制劑）過早釋放所造成的毒性。微管抑制劑可破壞間期微管功能，這對于將關鍵必需蛋白從神經元胞體主動轉運至遠端突觸至關重要，最終造成周圍神經腺瘤。
PN的特點為全身僵硬和疼痛，最終可能加重并造成極其腫脹和無力，一般在含膜滲透性MMAE有效荷載的ADC重復給藥后觀察到（與蛋白酶可裂解聯接子聯接，比如VC聯接子），但不表現在含膜不可滲透有效荷載MMAF的ADC中。據悉，PN是幾乎所有含膜滲透性美登素（DM1和DM4）有效荷載與可裂解聯接子結合的ADC的常見不良風波。
不僅在體循環中被動擴散游離膜滲透性有效荷載外，ADC通過受體依賴性或非依賴性機制的分布/攝入也可能發生在周圍神經中。為此，須要進行額外的體內調查研究，以明晰了解周圍神經的有效荷載/ADC曝露機制。值得注意的是，在臨床前植物模型中并不總能預測臨床中觀察到的PN。比如，對基于VC-MMAE的ADC進行的標準臨床前藥理學研究未能預測在臨床中觀察到的PN。但是，對于其他含微管抑制劑（如DM1或DM4）的非MMAEADC，若在臨床前種屬中觀察到PN，這些不良反應在臨床表現中的可預測性良好。
1.2旁觀者效應
不僅靶抗體陰性細胞攝入ADC后的直接細胞毒性外，ADC的游離有效荷載也可能通過旁觀者效應對毗鄰的靶抗體陽性細胞形成細胞毒性。在抒發抗體的靶細胞（靶抗體陰性）中，ADC經內化步入病變細胞后細胞膜透性，隨即在溶酶體中被分解代謝，并在細胞質中釋放出游離有效荷載。之后游離有效荷載既可以被動擴散步入細胞外間隙（膜滲透性、高親脂性有效荷載），也可以因為細胞膜完整性的失去而被釋放（靶細胞死亡后）。釋放的游離有效荷載可能通過被動擴散、轉運蛋白介導的攝入或通過其他非特異性內吞機制步入靶抗體陽性的正常細胞，進而導致細胞毒性。
ADC的旁觀者效應一般與癌癥殺傷（效果）降低相關，尤其是針對抗原抒發異質性的病變。使用體外菌落圓球試驗和共培養系統以及體內異種移植模型證明了旁觀者效應對于ADC效力和有效性的影響。但是，達到旁觀者效應所需的細胞膜滲透性降低也可能造成脫靶毒性。因此與采用不可裂解聯接子、不可滲透有效荷載的ADC相比，釋放的膜滲透性有效荷載可能溶入正常組織，并引起毒性降低。諸如，(Can-M)和(Can-R)是靶點CanAg（癌癥相關碳水化合物抗體，MUC1的一種新型糖型）的兩種ADC，但分別具有相對不穩定的SPP[N-琥珀酰吡啶基4-（2-氯苯基二甲基）戊醇類]聯接子/DM1和穩定的SPDB（N-琥珀酰吡啶基-4-（2-氯苯基二甲基）丁香豆素）聯接子/DM4的聯接子/有效荷載組合。但是，僅在接受Can-M醫治的實體瘤肝轉移病人中，觀察到肝毒性（尿酸下降），表明是因為ADC對毗鄰正常肝細胞的旁觀者效應所致[3]。ADC技術的最新進展帶來了細胞毒性有效荷載的發展，其可在癌癥細胞中代謝為膜不可滲透性代謝物（比如，）(，2016)。這些方式可能控制旁觀者效應帶來的不良影響--既保留殺害癌癥細胞的有益物理性質，同時也明顯減少針對正常細胞的四肢毒性。
非特異性內吞作用
內吞作用是細胞攝入營養物質、調節跨膜動力學和突觸囊泡再循環等的基本過程。內吞作用也可在大分子（包括IgG/ADC）攝入和分布至正常細胞中發揮重要作用。內吞作用大致分為吞噬作用（顆粒內化）和胞飲作用（可溶分子內化，亦稱為固相內吞作用）。據悉，依照內吞囊泡產生的大小，內吞作用已被分為大尺度和微尺度內吞過程。但是，在不同的已發表參考文獻中使用的內吞機制的不同命名中觀察到部份重疊概念并不稀少。可能造成IgG/ADC非特異性攝入的主要內吞機制的關鍵特點列于下表。
表2.主要內吞機制的關鍵特點
大尺度內吞作用包括吞噬作用和巨胞飲作用，分別涉及大顆粒或大容積部份的內化。吞噬作用涉及將大規模顆粒攝入到包圍顆粒的細胞膜變型（肌動蛋白的局部重排）中。富含ADC或ADC集聚體的免疫復合物也可能被該過程攝入。與吞噬作用相像，巨胞飲也是一種肌動蛋白依賴性過程，它涉及在相對大量的細胞外液（而不是顆粒）區域周圍產生質膜的褶皺延展，以介導內吞作用。微尺度的內吞過程涉及使用大小大于200nm的微粒體吞噬較小容積物質。這種過程常常須要像網格蛋白或小窩蛋白這樣的特殊殼體蛋白（圖2）。介導的內吞作用(CME)是大多數細胞類型中受體介導的微尺度內吞作用的主要方式，也是ADC靶點內化步入靶抗體/受體抒發細胞的主要機制。絡合物與特定膜受體的結合啟動了訊號風波的級聯反應，造成募集特定的接頭蛋白進行網格蛋白包被的囊泡產生（圖2），這種新產生的囊泡被動力蛋白（GTP酶）切斷，并釋放用于進一步的細胞內轉運。小窩蛋白介導的內吞作用涉及膜包被蛋白小窩蛋白產生的燒杯狀結構（小窩），它也依賴于動力蛋白進行囊泡分裂。小窩蛋白介導的攝入在許多細胞類型中起主要轉運作用，尤其是在內皮細胞中占優勢。重要的是要認識到，除網格蛋白和小窩蛋白介導的內吞作用外，還存在其他幾種微吞過程，包括CLIC/GEEC、ARF6、和四跨膜蛋白相關過程。
圖2.宏觀和微觀內吞過程的關鍵結構特點示意圖。吞噬作用涉及FcγR結合Cdc42（細胞分裂周期蛋白42）和Rac1（Ras相關C3保妥適毒素底物）的局部激活引起肌動蛋白聚合。巨胞飲過程涉及大量液體的攝入，形態學特點為褶皺的巨胞飲小體。小窩內吞作用的特點是通過電子顯微鏡(EM)可見與固醇相關的小窩的尖峰樣包被。最明晰的微尺度內吞過程包括網格蛋白介導的內吞作用，它涉及產生由網格蛋白三聚體組成的復雜晶格，產生剛毛外型的內體，可通過EM進行形態學鑒別。
無論涉及何種機制，內吞物質就會在細胞內得到加工，包括通過內溶酶體途徑的運輸。標記降解的物質從初期內體進展到晚期內體，之后步入其在溶酶體中的最終目的地。另外，內吞的物質可以通過回收內吞體重新回到細胞表面。其他運輸結果是轉胞作用到型腔空間或分選到不同的亞細胞區室，如高爾基復合體和葉綠體。細胞內轉運率也可能因內吞機制而異。諸如，已否認網格蛋白介導的內吞作用存在從初期內體返回細胞表面的快速再循環途徑。同樣，通過巨胞飲和吞噬作用內化的內容物也可能被回收，但更典型的是被加工用于溶酶體降解。有趣的是，在內皮細胞中，通過小窩介導的內吞作用內化的官能團優先分選到亞細胞區室中，以防止溶酶體降解途徑。
總體而言，上述宏觀和微觀內吞過程均可能有助于ADC被攝入步入正常細胞。關于正常細胞對ADC的非靶向依賴性攝入相關毒性，小窩依賴性內吞、巨胞飲和吞噬作用等非特異性內吞機制是潛在的重要機制。很顯著，不同正常組織和細胞類型的內吞機制和內吞總體速度也不同。許多特殊的免疫細胞（包括巨噬細胞和樹突狀細胞）特異性地將此作為主要功能，而且具有更高的內吞率。例如，已知細胞（腎臟中的固有巨噬細胞）在免疫結合物（包括ADC）的非特異性攝入和消除中發揮著重要作用。內皮細胞因為其在血管與間質室界面的戰略定位細胞膜透性，大分子的內吞率也相對較高。但是，目前仍未發表關于什么正常細胞類型和組織在細胞內活性最強的完整描述。為此，了解不同正常細胞/組織中的內吞速度對于理解非特異性內吞作為ADC攝入和毒性的潛在機制的作用具有重要價值。
2.1影響IgG/ADC非特異性內吞作用的誘因
大分子的理化性質可能影響其在正常細胞/組織中被內吞的可能性。IgG/ADC表面的分子電荷是共同影響抗原組織分布和PK的許多參數中的一個重要參數。帶正電荷的分子被大多數喂奶植物細胞膜以及細胞外基質（硝酸肝素蛋白聚糖）中帶負電荷的官能團吸引，這些近距離的集聚降低了局部含量，進而造成正常組織/細胞中更多的非特異性內吞攝入。既往調查性研究表明，IgG抗原凈正電荷的降低造成血清消除率降低，組織分布降低，而凈正電荷的降低會造成組織分布減輕。重要的是，等電點(pI)變化起碼1個單位或以上足以形成可檢測的組織分布和PK變化。這種推論也可能適用于ADC，支持ADC電荷可能影響正常細胞非特異性內吞作用的假定。為此，在未來的ADC設計方面，通過降低正電荷或平衡整體表面電荷分布來進行電荷修飾是一種值得考慮的方式。但須要注意的是，與正常組織相像，電荷修飾也可能影響癌癥細胞效果相關的靶抗體依賴性ADC攝入。優化ADC表面電荷以降低正常細胞的非靶向依賴性攝入，同時保留癌癥細胞的靶向介導攝入，可有利改善ADC的醫治指數。
ADC的疏水性也可能在其被正常細胞非特異性攝入中發揮作用。ADC中使用的許多抗生素-聯接子組合具有疏水性，尤其是對于具有高DAR的ADC。高DARADC疏水性的降低主要通過細胞和肝竇內皮細胞推動ADC集聚和加速非特異性清理。與肝細胞相像，具有高DAR的ADC可能被其他具有較高非特異性內吞能力的正常細胞迅速消除，造成非靶向依賴性（脫靶）毒性。譬如，對于基于MMAE的ADC，在體內大鼠模型中，DAR=4純化ADC的耐受性是DAR=8的ADC的2倍[4]。該推論一般也適用于其他ADC，因而DAR優化是改善ADC醫治指數的關鍵設計參數。偶聯和聯接子技術的最新進展可能克服高DARADC的那些何必要的PK問題。諸如，擬通過改建抗生素聯接子的疏水性或使用聚乙二醇(PEG)掩藏其固有的疏水性來增加ADC整體的疏水性，進而減少較高DAR組分的非特異性消除率，以改善ADC的PK特點和醫治指數。
2.2與非特異性內吞作用相關的ADC毒性
非特異性內吞作用（尤其是巨胞飲）被覺得是正常結膜上皮細胞和巨核細胞攝入ADC的途徑，分別造成眼毒性和血小板降低癥。巨噬細胞介導的結膜上皮細胞攝入的證據主要是因為人原代結膜上皮細胞(體外)對AGS-16C3F(靶點ENPP3抗體，含mc-MMAF聯接子-有效荷載的ADC)的細胞毒性減少，其正電荷和/或疏水性增加，而且與EIPA[5-(n-烷基-n-異氰基)-(巨噬細胞抑制劑)]共同抑制ADC攝入[5]?。在這項研究中，作者通過3種不同的機制改變了ADC電荷或疏水性，包括添加聚丙氨酸肽的聯接子、某些帶電多肽的突變改變以及PEG絡合物與抗原的聯接。在結膜上皮細胞中的這種實驗結果與電荷修飾（降低凈正電荷）改變正常細胞中ADC攝入和毒性的假定基本一致。在形成的9種突變抗原ADC（帶負電荷的多肽數目降低）中，3種在體外人結膜上皮細胞中顯示醫治指數改善[5]。
作者進一步報導了電荷修飾工程化ADC（正電荷減低）在其他一些正常細胞類型（HUVEC和成纖維細胞）中的攝入和毒性較低；但是，在巨核細胞中沒有觀察到一致的改善，以前報導巨核細胞對相同的非特異性攝入機制敏感[2]。據悉，很難將本研究中正常結膜上皮細胞的體外結果與實際體內改善相關聯，由于使用的兔模型中的面部結果顯示，在結膜上皮細胞中沒有任何腫瘤/缺陷（細胞毒性），正如其他ADC在臨床或其他植物模型中所報告的。
本研究結果總體上為電荷在人結膜上皮細胞非靶向依賴性攝入中的重要性提供有力證據，但關于攝入機制主要是巨胞飲的推論仍有待確定。ADC電荷修飾也可能影響結膜上皮細胞中其他潛在受體(FcγRs、CLRs)介導的攝入機制，本研究未完全排除這種機制。
同樣，調節巨胞飲介導的內化可增加ADC(AGS-16C3F)對巨核細胞的毒性（血小板降低癥）。但是，文獻中關于巨胞飲作為分化巨核細胞對于ADC的靶向依賴性攝入機制存在一些不一致。通過電子顯微鏡(EM)評價可最終確定巨胞飲，通過觀察到“皺褶”巨胞飲小體形態。EM評價結合標記的ADC有助于進一步否認正常細胞中巨胞飲介導的ADC攝入和亞細胞定位的參與。
未完待續，有關受體介導的攝入機制等相關內容，詳情詳見深入闡述正常細胞中ADC非靶向依賴性攝入和相關毒性的潛在機制（上篇）。
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