一文盤點常見ADC脫靶毒性有什么？其發(fā)生機制怎樣？有什么影響誘因？通過什么優(yōu)化舉措可以加以改善？
抗原抗生素偶聯(lián)物(ADC)是近些年來癌癥領(lǐng)域極具前景的一種新型根治方法，ADC平臺的概念是通過將細(xì)胞毒性抗生素選擇性地遞送至癌癥細(xì)胞，但是限制曝露于健康的正常細(xì)胞，進(jìn)而降低細(xì)胞毒性抗生素的醫(yī)治指數(shù)。雖然ADC相比傳統(tǒng)放療的靶點性大大提高，而且也不可防止報告正常細(xì)胞/組織中的劑量限制性毒性(DLT)。目前，DLT一直是ADC開發(fā)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。ADC在正常細(xì)胞/組織中的毒性機制尚不清楚，但覺得大多數(shù)DLT與靶向無關(guān)。不僅聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定性引起循環(huán)中細(xì)胞毒性抗生素（有效荷載）過早釋放外，受體依賴性（FcγR、FcRn和C型凝集素受體）和受體非依賴性（非特異性內(nèi)吞）機制攝入/轉(zhuǎn)運ADC可能造成正常細(xì)胞的脫靶毒性。發(fā)表在《Ther》上的一篇綜述[1]，回顧了正常細(xì)胞中ADC非靶向依賴性攝入和毒性的潛在機制，并討論了可能影響這種機制的潛在誘因。相關(guān)內(nèi)容能為愈發(fā)深入地了解ADC脫靶毒性的潛在機制提供根據(jù)，有助于開發(fā)規(guī)避這種機制的方式，從而改善下一代ADC的總體醫(yī)治指數(shù)。現(xiàn)將該綜述中有關(guān)聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定性、非特異性內(nèi)吞作用的相關(guān)內(nèi)容梳理如下，以饗讀者。
ADC抗生素非靶向依賴性攝入和毒性的機制
雖然ADC毒性被覺得主要來始于有效荷載，但非靶點正常細(xì)胞攝入ADC，并釋放出有效荷載因而形成毒性的相死機制尚不清楚。這些攝入可通過多種機制發(fā)生，目前正在進(jìn)行相關(guān)研究來了解這種機制并優(yōu)化ADC的三種關(guān)鍵組分（即單克隆抗原、連接子和有效荷載）。按照大多數(shù)恐怕值，ADC在人體靶（病變）部位僅發(fā)生適度的積聚（每克病變約0.1%的給藥劑量）。為此，ADC的主要部份保留在循環(huán)中或分布到正常組織中，可能被攝入和分解代謝，造成正常細(xì)胞毒性。靶向依賴性和非依賴性攝入機制均可能導(dǎo)致正常細(xì)胞的ADC攝入和毒性。本綜述將重點關(guān)注正常細(xì)胞對ADC非靶向依賴性攝入（亦稱為非特異性攝入）及其可能造成的脫靶毒性的機制等相關(guān)內(nèi)容。
表1.ADC中使用的不同類別有效荷載的詳盡信息和臨床研究中一般報告的主要毒性
聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定性
聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定性可造成有效荷載過早釋放到血液中，并造成ADC的脫靶毒性。聯(lián)接子的選擇是ADC穩(wěn)定性背后的主要驅(qū)動誘因之一。第一代ADC抗生素采用酸可裂解聯(lián)接子（比如，腙），其被設(shè)計為在血清中性pH環(huán)境中穩(wěn)定，但ADC內(nèi)化后能在溶酶體內(nèi)較低pH條件下釋放。
但是，這種初期ADC常常遭到血清穩(wěn)定性差的困惑，進(jìn)而造成循環(huán)中有效荷載的開裂（圖1）。造成ADC血清不穩(wěn)定性的誘因包括對血漿蛋白酶的敏感性，尤其是基于肽的聯(lián)接子和自發(fā)去偶聯(lián)，如逆轉(zhuǎn)錄酶-馬來酰吡啶轉(zhuǎn)移到血清蛋白上存在的游離胺類上。除安全性問題外，不穩(wěn)定ADC的效果也可能增加，由于抵達(dá)病變的ADC不再完整偶聯(lián)有效荷載。在個別情況下，引入不可裂解聯(lián)接子可減輕聯(lián)接子裂解問題。比較具有可裂解聯(lián)接子（SPP-DM1和mc-VC-PAB-MMAE）和不可裂解聯(lián)接子（mcc-DM1和mc-MMAF）類型ADC的結(jié)果顯示，對于特定靶標(biāo)(CD22)，具有不可裂解聯(lián)接子的ADC的毒性（腎臟和血液學(xué)毒性）減少。同樣，與富含可裂解二硫鍵的美登素類ADC相比，含不可裂解硫醇MCC聯(lián)接子的ADC，其臨床前安全性特點得到改善。采用不可裂解聯(lián)接子ADC的毒性減少被覺得是因為步入體循環(huán)的游離細(xì)胞毒性有效荷載釋放降低。但是，并非所有靶抗體均適用于含不可裂解聯(lián)接子的ADC的醫(yī)治，由于須要將完整的mAb分解代謝能夠釋放聯(lián)接抗生素以發(fā)揮抗病變作用。
圖1.正常細(xì)胞攝入ADC或游離有效荷載的潛在機制。靶抗體可能在正常細(xì)胞上抒發(fā)，并有助于ADC的靶向依賴性攝入。據(jù)悉，結(jié)合IgG抗原Fc保守區(qū)的其他受體，如Fcγ受體(FcγR)、新生兒Fc受體(FcRn)和C型凝集素受體(CLR)也可能有助于正常細(xì)胞中ADC的非靶向依賴性內(nèi)化/轉(zhuǎn)運。非特異性內(nèi)吞機制，如巨胞飲或小胞飲也可能造成完整ADC或游離有效荷載內(nèi)化（因為聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定或胞外蛋白酶活性在細(xì)胞外釋放）。游離有效荷載也可能通過其他機制步入正常細(xì)胞，如被動擴(kuò)散（假如具有膜滲透性）、非特異性內(nèi)吞或特異性轉(zhuǎn)運蛋白（假如膜轉(zhuǎn)運蛋白的底物）介導(dǎo)的攝入。據(jù)悉，抗體陰性靶細(xì)胞還能否通過將有效荷載釋放到局部環(huán)境中介導(dǎo)毒性，隨即被抗體陽性正常細(xì)胞（旁觀者效應(yīng)）通過被動擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的攝入或通過其他非特異性內(nèi)吞機制攝入。
含可裂解聯(lián)接子的ADC也可能通過旁觀者效應(yīng)降低效果，是針對拷貝數(shù)較低、腫瘤抒發(fā)異質(zhì)性或內(nèi)化率較低的癌癥細(xì)胞靶抗體的首選。為此，聯(lián)接子-抗生素穩(wěn)定性一直是未來ADC研制優(yōu)化的關(guān)鍵領(lǐng)域，致力最大限度地增強獲得成功的ADC的機率。對于作用強效和具有膜滲透性的細(xì)胞毒素，如吡啶苯二氮卓類(PBD)，關(guān)注含這種有效荷載的ADC的穩(wěn)定性尤其重要。據(jù)悉，不僅聯(lián)接子的可裂解性，釋放有效荷載的膜滲透性同樣可能影響正常細(xì)胞中潛在的脫靶細(xì)胞毒性，因而影響ADC的醫(yī)治指數(shù)。
結(jié)合位點也可能調(diào)節(jié)ADC的穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)。使用表面曝露的多肽（如賴谷氨酸或半胱谷氨酸）的傳統(tǒng)非特異性偶聯(lián)方式會形成高度異質(zhì)性的ADC（抗生素-抗原比[DAR]，0-8），進(jìn)而造成ADC的集聚機會降低，但是其整體血清穩(wěn)定性也會增加。因而，這種采用非特異性結(jié)合位點的ADC也可能造成正常細(xì)胞中非靶向依賴性攝入和毒性降低的安全性挑戰(zhàn)。近些年來，先進(jìn)的聯(lián)接子技術(shù)和對結(jié)合位點認(rèn)識的提升形成了更多的均一性高的ADC，同時改善了總體聯(lián)接子-抗生素的穩(wěn)定性并降低了血清中細(xì)胞毒性有效荷載的過早開裂。那些具有更高聯(lián)接子-抗生素穩(wěn)定性的ADC也可以發(fā)生更多由靶向驅(qū)動的有效荷載釋放，進(jìn)而提升效果。為此，各類偶聯(lián)位點工程策略，包括使用特定多肽（天然或工程）、Fc聚糖和短肽標(biāo)簽的幾種特異性位點偶聯(lián)，已被用于生成具有改善安全性特點的DAR均質(zhì)性ADC。
比如，采用首個特異性位點偶聯(lián)技術(shù)--（未配對半胱谷氨酸介導(dǎo)的偶聯(lián)）偶聯(lián)技術(shù)的ADC，其在臨床前的耐受性相對優(yōu)于具有相同有效荷載和非特異性偶聯(lián)技術(shù)的傳統(tǒng)ADC。據(jù)悉，在臨床前研究中，由半胱谷氨酸工程抗原和PBD（使用新型起火二硫鍵聯(lián)接子）組成的ADC顯示出改善的安全性特點（減少毒性），且效果相當(dāng)，表明其可潛在降低ADC的醫(yī)治指數(shù)。
1.1與聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定性相關(guān)的ADC毒性
中性粒細(xì)胞降低癥（中性粒細(xì)胞計數(shù)減少）是ADC的一種重要的非靶向依賴性DLT，因為血清中可裂解聯(lián)接子不穩(wěn)定，造成膜滲透性游離有效荷載提早釋放。中性粒細(xì)胞降低是許多通過蛋白酶可裂解的纈氨酸-瓜谷氨酸（VC）聯(lián)接子與MMAE結(jié)合而成的ADC的常見毒性，如、ASG-5ME、、、和PSMAADC。Zhao等人[2]近來進(jìn)行的一項體外機制研究表明，基于VC-MMAE的ADC誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞降低癥是因為釋放的有效荷載對骨髓中分化的中性粒細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性作用所致。按照聯(lián)接子物理，VC聯(lián)接子預(yù)期在溶酶體中發(fā)生細(xì)胞內(nèi)半胱谷氨酸蛋白酶介導(dǎo)的裂解。Zhao等人[2]的研究結(jié)果闡明，在骨髓微環(huán)境中局部分化的中性粒細(xì)胞分泌的谷氨酸蛋白酶有助于VC聯(lián)接子在細(xì)胞外的切割，并釋放膜滲透性MMAE造成對骨髓中分化的中性粒細(xì)胞的細(xì)胞毒性。但是，這項研究的結(jié)果提出了另一個問題，即為何在骨髓細(xì)胞外釋放的膜滲透性MMAE有效荷載僅對分化的中性粒細(xì)胞（髓系細(xì)胞）有毒性，而對骨髓中的其他多種敏感細(xì)胞類型如造血干/祖細(xì)胞、紅系和巨核細(xì)胞系細(xì)胞沒有毒性，因此這須要進(jìn)一步研究論證，非常是使用體內(nèi)模型比較基于可裂解和不可裂解聯(lián)接子-MMAE的ADC的血液毒性（非常是分化骨髓細(xì)胞的毒性），以明晰了解和否認(rèn)細(xì)胞外氨酸蛋白酶在中性粒細(xì)胞降低癥中的作用。
同樣，周圍神經(jīng)腫瘤（PN，周圍神經(jīng)損傷的結(jié)果）是另一種與微管抑制劑ADC（不考慮靶抗體）相關(guān)、導(dǎo)致醫(yī)治終止和/或劑量增加的重要非靶向依賴性臨床毒性。PN被覺得是由聯(lián)接子-抗生素不穩(wěn)定性驅(qū)動，因而造成體循環(huán)中膜滲透性游離有效荷載（微管抑制劑）過早釋放所造成的毒性。微管抑制劑可破壞間期微管功能，這對于將關(guān)鍵必需蛋白從神經(jīng)元胞體主動轉(zhuǎn)運至遠(yuǎn)端突觸至關(guān)重要，最終造成周圍神經(jīng)腺瘤。
PN的特點為全身僵硬和疼痛，最終可能加重并造成極其腫脹和無力，一般在含膜滲透性MMAE有效荷載的ADC重復(fù)給藥后觀察到（與蛋白酶可裂解聯(lián)接子聯(lián)接，比如VC聯(lián)接子），但不表現(xiàn)在含膜不可滲透有效荷載MMAF的ADC中。據(jù)悉，PN是幾乎所有含膜滲透性美登素（DM1和DM4）有效荷載與可裂解聯(lián)接子結(jié)合的ADC的常見不良風(fēng)波。
不僅在體循環(huán)中被動擴(kuò)散游離膜滲透性有效荷載外，ADC通過受體依賴性或非依賴性機制的分布/攝入也可能發(fā)生在周圍神經(jīng)中。為此，須要進(jìn)行額外的體內(nèi)調(diào)查研究，以明晰了解周圍神經(jīng)的有效荷載/ADC曝露機制。值得注意的是，在臨床前植物模型中并不總能預(yù)測臨床中觀察到的PN。比如，對基于VC-MMAE的ADC進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)臨床前藥理學(xué)研究未能預(yù)測在臨床中觀察到的PN。但是，對于其他含微管抑制劑（如DM1或DM4）的非MMAEADC，若在臨床前種屬中觀察到PN，這些不良反應(yīng)在臨床表現(xiàn)中的可預(yù)測性良好。
1.2旁觀者效應(yīng)
不僅靶抗體陰性細(xì)胞攝入ADC后的直接細(xì)胞毒性外，ADC的游離有效荷載也可能通過旁觀者效應(yīng)對毗鄰的靶抗體陽性細(xì)胞形成細(xì)胞毒性。在抒發(fā)抗體的靶細(xì)胞（靶抗體陰性）中，ADC經(jīng)內(nèi)化步入病變細(xì)胞后細(xì)胞膜透性，隨即在溶酶體中被分解代謝，并在細(xì)胞質(zhì)中釋放出游離有效荷載。之后游離有效荷載既可以被動擴(kuò)散步入細(xì)胞外間隙（膜滲透性、高親脂性有效荷載），也可以因為細(xì)胞膜完整性的失去而被釋放（靶細(xì)胞死亡后）。釋放的游離有效荷載可能通過被動擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的攝入或通過其他非特異性內(nèi)吞機制步入靶抗體陽性的正常細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
ADC的旁觀者效應(yīng)一般與癌癥殺傷（效果）降低相關(guān)，尤其是針對抗原抒發(fā)異質(zhì)性的病變。使用體外菌落圓球試驗和共培養(yǎng)系統(tǒng)以及體內(nèi)異種移植模型證明了旁觀者效應(yīng)對于ADC效力和有效性的影響。但是，達(dá)到旁觀者效應(yīng)所需的細(xì)胞膜滲透性降低也可能造成脫靶毒性。因此與采用不可裂解聯(lián)接子、不可滲透有效荷載的ADC相比，釋放的膜滲透性有效荷載可能溶入正常組織，并引起毒性降低。諸如，(Can-M)和(Can-R)是靶點CanAg（癌癥相關(guān)碳水化合物抗體，MUC1的一種新型糖型）的兩種ADC，但分別具有相對不穩(wěn)定的SPP[N-琥珀酰吡啶基4-（2-氯苯基二甲基）戊醇類]聯(lián)接子/DM1和穩(wěn)定的SPDB（N-琥珀酰吡啶基-4-（2-氯苯基二甲基）丁香豆素）聯(lián)接子/DM4的聯(lián)接子/有效荷載組合。但是，僅在接受Can-M醫(yī)治的實體瘤肝轉(zhuǎn)移病人中，觀察到肝毒性（尿酸下降），表明是因為ADC對毗鄰正常肝細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)所致[3]。ADC技術(shù)的最新進(jìn)展帶來了細(xì)胞毒性有效荷載的發(fā)展，其可在癌癥細(xì)胞中代謝為膜不可滲透性代謝物（比如，）(，2016)。這些方式可能控制旁觀者效應(yīng)帶來的不良影響--既保留殺害癌癥細(xì)胞的有益物理性質(zhì)，同時也明顯減少針對正常細(xì)胞的四肢毒性。
非特異性內(nèi)吞作用
內(nèi)吞作用是細(xì)胞攝入營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)跨膜動力學(xué)和突觸囊泡再循環(huán)等的基本過程。內(nèi)吞作用也可在大分子（包括IgG/ADC）攝入和分布至正常細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。內(nèi)吞作用大致分為吞噬作用（顆粒內(nèi)化）和胞飲作用（可溶分子內(nèi)化，亦稱為固相內(nèi)吞作用）。據(jù)悉，依照內(nèi)吞囊泡產(chǎn)生的大小，內(nèi)吞作用已被分為大尺度和微尺度內(nèi)吞過程。但是，在不同的已發(fā)表參考文獻(xiàn)中使用的內(nèi)吞機制的不同命名中觀察到部份重疊概念并不稀少。可能造成IgG/ADC非特異性攝入的主要內(nèi)吞機制的關(guān)鍵特點列于下表。
表2.主要內(nèi)吞機制的關(guān)鍵特點
大尺度內(nèi)吞作用包括吞噬作用和巨胞飲作用，分別涉及大顆粒或大容積部份的內(nèi)化。吞噬作用涉及將大規(guī)模顆粒攝入到包圍顆粒的細(xì)胞膜變型（肌動蛋白的局部重排）中。富含ADC或ADC集聚體的免疫復(fù)合物也可能被該過程攝入。與吞噬作用相像，巨胞飲也是一種肌動蛋白依賴性過程，它涉及在相對大量的細(xì)胞外液（而不是顆粒）區(qū)域周圍產(chǎn)生質(zhì)膜的褶皺延展，以介導(dǎo)內(nèi)吞作用。微尺度的內(nèi)吞過程涉及使用大小大于200nm的微粒體吞噬較小容積物質(zhì)。這種過程常常須要像網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白這樣的特殊殼體蛋白（圖2）。介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(CME)是大多數(shù)細(xì)胞類型中受體介導(dǎo)的微尺度內(nèi)吞作用的主要方式，也是ADC靶點內(nèi)化步入靶抗體/受體抒發(fā)細(xì)胞的主要機制。絡(luò)合物與特定膜受體的結(jié)合啟動了訊號風(fēng)波的級聯(lián)反應(yīng)，造成募集特定的接頭蛋白進(jìn)行網(wǎng)格蛋白包被的囊泡產(chǎn)生（圖2），這種新產(chǎn)生的囊泡被動力蛋白（GTP酶）切斷，并釋放用于進(jìn)一步的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用涉及膜包被蛋白小窩蛋白產(chǎn)生的燒杯狀結(jié)構(gòu)（小窩），它也依賴于動力蛋白進(jìn)行囊泡分裂。小窩蛋白介導(dǎo)的攝入在許多細(xì)胞類型中起主要轉(zhuǎn)運作用，尤其是在內(nèi)皮細(xì)胞中占優(yōu)勢。重要的是要認(rèn)識到，除網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用外，還存在其他幾種微吞過程，包括CLIC/GEEC、ARF6、和四跨膜蛋白相關(guān)過程。
圖2.宏觀和微觀內(nèi)吞過程的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特點示意圖。吞噬作用涉及FcγR結(jié)合Cdc42（細(xì)胞分裂周期蛋白42）和Rac1（Ras相關(guān)C3保妥適毒素底物）的局部激活引起肌動蛋白聚合。巨胞飲過程涉及大量液體的攝入，形態(tài)學(xué)特點為褶皺的巨胞飲小體。小窩內(nèi)吞作用的特點是通過電子顯微鏡(EM)可見與固醇相關(guān)的小窩的尖峰樣包被。最明晰的微尺度內(nèi)吞過程包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，它涉及產(chǎn)生由網(wǎng)格蛋白三聚體組成的復(fù)雜晶格，產(chǎn)生剛毛外型的內(nèi)體，可通過EM進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別。
無論涉及何種機制，內(nèi)吞物質(zhì)就會在細(xì)胞內(nèi)得到加工，包括通過內(nèi)溶酶體途徑的運輸。標(biāo)記降解的物質(zhì)從初期內(nèi)體進(jìn)展到晚期內(nèi)體，之后步入其在溶酶體中的最終目的地。另外，內(nèi)吞的物質(zhì)可以通過回收內(nèi)吞體重新回到細(xì)胞表面。其他運輸結(jié)果是轉(zhuǎn)胞作用到型腔空間或分選到不同的亞細(xì)胞區(qū)室，如高爾基復(fù)合體和葉綠體。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運率也可能因內(nèi)吞機制而異。諸如，已否認(rèn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用存在從初期內(nèi)體返回細(xì)胞表面的快速再循環(huán)途徑。同樣，通過巨胞飲和吞噬作用內(nèi)化的內(nèi)容物也可能被回收，但更典型的是被加工用于溶酶體降解。有趣的是，在內(nèi)皮細(xì)胞中，通過小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化的官能團(tuán)優(yōu)先分選到亞細(xì)胞區(qū)室中，以防止溶酶體降解途徑。
總體而言，上述宏觀和微觀內(nèi)吞過程均可能有助于ADC被攝入步入正常細(xì)胞。關(guān)于正常細(xì)胞對ADC的非靶向依賴性攝入相關(guān)毒性，小窩依賴性內(nèi)吞、巨胞飲和吞噬作用等非特異性內(nèi)吞機制是潛在的重要機制。很顯著，不同正常組織和細(xì)胞類型的內(nèi)吞機制和內(nèi)吞總體速度也不同。許多特殊的免疫細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）特異性地將此作為主要功能，而且具有更高的內(nèi)吞率。例如，已知細(xì)胞（腎臟中的固有巨噬細(xì)胞）在免疫結(jié)合物（包括ADC）的非特異性攝入和消除中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞因為其在血管與間質(zhì)室界面的戰(zhàn)略定位細(xì)胞膜透性，大分子的內(nèi)吞率也相對較高。但是，目前仍未發(fā)表關(guān)于什么正常細(xì)胞類型和組織在細(xì)胞內(nèi)活性最強的完整描述。為此，了解不同正常細(xì)胞/組織中的內(nèi)吞速度對于理解非特異性內(nèi)吞作為ADC攝入和毒性的潛在機制的作用具有重要價值。
2.1影響IgG/ADC非特異性內(nèi)吞作用的誘因
大分子的理化性質(zhì)可能影響其在正常細(xì)胞/組織中被內(nèi)吞的可能性。IgG/ADC表面的分子電荷是共同影響抗原組織分布和PK的許多參數(shù)中的一個重要參數(shù)。帶正電荷的分子被大多數(shù)喂奶植物細(xì)胞膜以及細(xì)胞外基質(zhì)（硝酸肝素蛋白聚糖）中帶負(fù)電荷的官能團(tuán)吸引，這些近距離的集聚降低了局部含量，進(jìn)而造成正常組織/細(xì)胞中更多的非特異性內(nèi)吞攝入。既往調(diào)查性研究表明，IgG抗原凈正電荷的降低造成血清消除率降低，組織分布降低，而凈正電荷的降低會造成組織分布減輕。重要的是，等電點(pI)變化起碼1個單位或以上足以形成可檢測的組織分布和PK變化。這種推論也可能適用于ADC，支持ADC電荷可能影響正常細(xì)胞非特異性內(nèi)吞作用的假定。為此，在未來的ADC設(shè)計方面，通過降低正電荷或平衡整體表面電荷分布來進(jìn)行電荷修飾是一種值得考慮的方式。但須要注意的是，與正常組織相像，電荷修飾也可能影響癌癥細(xì)胞效果相關(guān)的靶抗體依賴性ADC攝入。優(yōu)化ADC表面電荷以降低正常細(xì)胞的非靶向依賴性攝入，同時保留癌癥細(xì)胞的靶向介導(dǎo)攝入，可有利改善ADC的醫(yī)治指數(shù)。
ADC的疏水性也可能在其被正常細(xì)胞非特異性攝入中發(fā)揮作用。ADC中使用的許多抗生素-聯(lián)接子組合具有疏水性，尤其是對于具有高DAR的ADC。高DARADC疏水性的降低主要通過細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞推動ADC集聚和加速非特異性清理。與肝細(xì)胞相像，具有高DAR的ADC可能被其他具有較高非特異性內(nèi)吞能力的正常細(xì)胞迅速消除，造成非靶向依賴性（脫靶）毒性。譬如，對于基于MMAE的ADC，在體內(nèi)大鼠模型中，DAR=4純化ADC的耐受性是DAR=8的ADC的2倍[4]。該推論一般也適用于其他ADC，因而DAR優(yōu)化是改善ADC醫(yī)治指數(shù)的關(guān)鍵設(shè)計參數(shù)。偶聯(lián)和聯(lián)接子技術(shù)的最新進(jìn)展可能克服高DARADC的那些何必要的PK問題。諸如，擬通過改建抗生素聯(lián)接子的疏水性或使用聚乙二醇(PEG)掩藏其固有的疏水性來增加ADC整體的疏水性，進(jìn)而減少較高DAR組分的非特異性消除率，以改善ADC的PK特點和醫(yī)治指數(shù)。
2.2與非特異性內(nèi)吞作用相關(guān)的ADC毒性
非特異性內(nèi)吞作用（尤其是巨胞飲）被覺得是正常結(jié)膜上皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞攝入ADC的途徑，分別造成眼毒性和血小板降低癥。巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)膜上皮細(xì)胞攝入的證據(jù)主要是因為人原代結(jié)膜上皮細(xì)胞(體外)對AGS-16C3F(靶點ENPP3抗體，含mc-MMAF聯(lián)接子-有效荷載的ADC)的細(xì)胞毒性減少，其正電荷和/或疏水性增加，而且與EIPA[5-(n-烷基-n-異氰基)-(巨噬細(xì)胞抑制劑)]共同抑制ADC攝入[5]?。在這項研究中，作者通過3種不同的機制改變了ADC電荷或疏水性，包括添加聚丙氨酸肽的聯(lián)接子、某些帶電多肽的突變改變以及PEG絡(luò)合物與抗原的聯(lián)接。在結(jié)膜上皮細(xì)胞中的這種實驗結(jié)果與電荷修飾（降低凈正電荷）改變正常細(xì)胞中ADC攝入和毒性的假定基本一致。在形成的9種突變抗原ADC（帶負(fù)電荷的多肽數(shù)目降低）中，3種在體外人結(jié)膜上皮細(xì)胞中顯示醫(yī)治指數(shù)改善[5]。
作者進(jìn)一步報導(dǎo)了電荷修飾工程化ADC（正電荷減低）在其他一些正常細(xì)胞類型（HUVEC和成纖維細(xì)胞）中的攝入和毒性較低；但是，在巨核細(xì)胞中沒有觀察到一致的改善，以前報導(dǎo)巨核細(xì)胞對相同的非特異性攝入機制敏感[2]。據(jù)悉，很難將本研究中正常結(jié)膜上皮細(xì)胞的體外結(jié)果與實際體內(nèi)改善相關(guān)聯(lián)，由于使用的兔模型中的面部結(jié)果顯示，在結(jié)膜上皮細(xì)胞中沒有任何腫瘤/缺陷（細(xì)胞毒性），正如其他ADC在臨床或其他植物模型中所報告的。
本研究結(jié)果總體上為電荷在人結(jié)膜上皮細(xì)胞非靶向依賴性攝入中的重要性提供有力證據(jù)，但關(guān)于攝入機制主要是巨胞飲的推論仍有待確定。ADC電荷修飾也可能影響結(jié)膜上皮細(xì)胞中其他潛在受體(FcγRs、CLRs)介導(dǎo)的攝入機制，本研究未完全排除這種機制。
同樣，調(diào)節(jié)巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)化可增加ADC(AGS-16C3F)對巨核細(xì)胞的毒性（血小板降低癥）。但是，文獻(xiàn)中關(guān)于巨胞飲作為分化巨核細(xì)胞對于ADC的靶向依賴性攝入機制存在一些不一致。通過電子顯微鏡(EM)評價可最終確定巨胞飲，通過觀察到“皺褶”巨胞飲小體形態(tài)。EM評價結(jié)合標(biāo)記的ADC有助于進(jìn)一步否認(rèn)正常細(xì)胞中巨胞飲介導(dǎo)的ADC攝入和亞細(xì)胞定位的參與。
未完待續(xù)，有關(guān)受體介導(dǎo)的攝入機制等相關(guān)內(nèi)容，詳情詳見深入闡述正常細(xì)胞中ADC非靶向依賴性攝入和相關(guān)毒性的潛在機制（上篇）。
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