《生命的物理》2009年29卷3期·490·●OFLIFE2009，29(3)文章編號:1000-1336(2009)04-0490-05細胞冷藏冰晶損傷和應(yīng)激損傷機理袁曉華(成都血液中心，成都)摘要：高溫下保存生物材料可使臨床研究不受限于時間空間，安全有效的細胞凍存可以為組織工程、基因醫(yī)治和細胞移植提供豐富的細胞來源。冷藏保存早已成功應(yīng)用于許多細胞株系，但不同來源的細胞系凍存效率差距很大，仍有細胞系在提升高溫凍存效率時面臨困局未能突破。細胞冷藏損傷機理在冰晶損傷和細胞應(yīng)激損傷方面還有待更深入的了解，本文將集中討論近些年來這方面的一些研究進展。關(guān)鍵詞：冷藏損傷；胞內(nèi)冰晶；間隙聯(lián)接；調(diào)亡；熱激蛋白中圖分類號：Q65/Q813自從1949年P(guān)olge等意外發(fā)覺甘油對家畜精液身不是絕對有害的，它取決于那些冰晶是否會在復(fù)[1]的冷藏保護作用以來，人們?nèi)匀辉谔角蠹毎洳負p溫過程以微小冰晶為核，發(fā)生再結(jié)晶。近些年Acker[2-5]傷的機制，希望才能從中找尋一些復(fù)雜細胞組織未等對細胞冷藏過程中胞內(nèi)外冰晶的產(chǎn)生機制作了能實現(xiàn)高溫凍存的緣由并開發(fā)新的途徑。
通常覺得一系列的研究，提出了無害胞內(nèi)冰[2]在降溫和升溫過程中細胞內(nèi)外水份的結(jié)晶程度和溫ice)。她們比較了單個培養(yǎng)和雙層度變化速度達到最佳平衡是至關(guān)重要的，通過對不培養(yǎng)細胞冷藏時的胞內(nèi)冰晶對細胞復(fù)蘇率的影響，同來源的細胞采取不同的冷藏保護劑配方，調(diào)節(jié)降覺得對于單個細胞，胞內(nèi)冰的成核生長對細胞有害，溫升溫速度，最大限度地防止冰晶的生長和細胞體但對于以雙層細胞方式冷藏來說，胞內(nèi)冰沿細胞間積過度變化，使許多株系的細胞得到成功凍存。但隙在相鄰細胞的擴散是無害的，甚至部份胞內(nèi)冰的還有許多細胞株在提升冷藏保存效率時面臨困局無產(chǎn)生避開了細胞過度脫水和容積驟起對細胞膜、細法突破，這彰顯了細胞對冷藏損傷反應(yīng)的種屬特異胞器導(dǎo)致的損害，具有冷藏保護作用。而胞外冰晶性，“耐凍”與“不耐凍”細胞株之間的區(qū)別在那里？的產(chǎn)生也不是絕對無害的，如人胚胎干細胞以保濕本文綜述了近些年來細胞冷藏損傷機理研究方面的一的細胞團方式冷藏保存，胞外冰晶的產(chǎn)生會破壞細[8]些進展。胞的間隙聯(lián)接，導(dǎo)致細胞島團松散，復(fù)蘇率極低。1.細胞凍存中的冰晶損傷總的來說，細胞以單個細胞懸液、單層細胞還是以Mazur的“兩誘因假說”將細胞冷藏損傷歸結(jié)于多層細胞團方式凍存會導(dǎo)致冰晶的生長模式的不[6]“溶質(zhì)損傷”和“胞內(nèi)冰損傷”兩大誘因，人們也是同；冰晶的產(chǎn)生不是絕對有害的，細胞冷藏降溫從盡量避開此兩種傷害來設(shè)計機油成份及降溫速過程中產(chǎn)生的胞內(nèi)冰晶是否會對細胞導(dǎo)致致命損傷率來凍存細胞。
但細胞凍存過程中細胞內(nèi)外冰晶的取決于冰晶的數(shù)目、大小、形成位置以及復(fù)溫條件。產(chǎn)生機制以及其對細胞導(dǎo)致致命損傷的機制有待更2.細胞間隙聯(lián)接對冷藏損傷的作用深入的研究。在細胞降溫過程中微小冰晶的產(chǎn)生本細胞間隙聯(lián)接(gap)是存在于大多數(shù)植物組織細胞之間或細胞與細胞外基質(zhì)之間的一種聯(lián)接結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的喂奶植物細胞在冷藏保存時，如收稿日期：2009-02-23果以單細胞懸液的方式進行保存，細胞在加入防寒作者簡介：袁曉華(1980-)，女，碩士，聯(lián)系作者，E-mail:@液后與之接觸充分，使火花塞的滲透才能較完全，《生命的物理》2009年29卷4期●新進展·491·OFLIFE2009，29(4)細胞復(fù)蘇率較高。但對于有些細胞，如人和靈長類DMSO、甘油、乙二醇等等來防止冰晶損傷，另外通的胚胎干細胞株系，細胞以島團狀形式生長，細胞過添加膜穩(wěn)定劑如海藻糖，多肽等和生物抗氧化[18]之間存在間隙聯(lián)接，緊密的細胞聯(lián)接和細胞旁分泌劑來緩解滲透性損傷穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)，這種方式均因子對維持其體外未分化生長至關(guān)重要，所以細胞能明顯改善細胞回產(chǎn)率。
但細胞冷藏損傷還包括氧凍存時必須以含100~200個以上細胞的結(jié)節(jié)方式進化應(yīng)激反應(yīng)，自由基釋放，Na/K-ATP酶抑制造成離[9,20]行的。這樣影響了細胞與機油的接觸，此時細子內(nèi)環(huán)境衰弱等，這種風(fēng)波會成為細胞在防止機械胞間隙聯(lián)接的存在對冰晶生長的影響可能是導(dǎo)致其損傷后復(fù)蘇培養(yǎng)后的一段時間內(nèi)仍發(fā)生自噬的剌激[10]冷藏保存效率低下的緣由，這對皮膚等組織的冷藏誘因細胞膜損傷，導(dǎo)致凍存細胞存在生存極限(cap)，保存研究也具有重要意義。即改進了機油配方和降溫速度后細胞始終未能提復(fù)雜細胞組織冷藏時，胞內(nèi)冰在細胞層內(nèi)隨機高復(fù)蘇率。近些年來，研究者對其發(fā)生機制和解決方產(chǎn)生，之后向相鄰細胞間擴散，使胞內(nèi)冰的產(chǎn)生機案進行了探求。[4]率大大降低，其擴散方向不是隨機的(如圖1所示)，細胞自噬是一個復(fù)雜的病理生理過程，包括細這一現(xiàn)象廣泛存在于復(fù)雜細胞組織冷藏中。后來的胞外途徑和細胞內(nèi)途徑：細胞外途徑即細胞膜死亡研究表明，細胞之間的接觸和胞內(nèi)冰的產(chǎn)生有密切受體(如Fas、TNFR、TRAIL)與官能團結(jié)合后啟動FADD[1]關(guān)系。等總結(jié)了細胞內(nèi)外冰晶生長擴散模式途徑，由-8介導(dǎo)小游訊號傳導(dǎo)；細胞內(nèi)途徑的兩種說法：一種是表面推動成核說(-cata-即在各類應(yīng)激反應(yīng)下線粒體跨膜勢能增長，細胞色lyzed,SCN)，覺得是細胞膜與胞外冰晶接素C釋放，由-9介導(dǎo)下游訊號傳導(dǎo)。
這兩條觸，成為胞內(nèi)冰的成核位點，這一理論解釋了細胞途徑均激活胱天蛋白酶()級聯(lián)反應(yīng)，造成細外冰晶對胞內(nèi)冰成核的影響；另一說法覺得胞內(nèi)冰胞發(fā)生自噬。在對外周血單核細胞冷藏損傷中的凋晶是通過相鄰細胞膜上的間隙聯(lián)接向周圍生長擴散。亡風(fēng)波研究中覺得，細胞凍融過程中發(fā)生的自噬是[12]近些年的實驗表明，間隙聯(lián)接的確在冰晶擴散生長中通過線粒體介導(dǎo)的，依賴胱天蛋白酶途徑執(zhí)行的。[4]發(fā)揮作用，但是具有體溫依賴性。最初冰晶在細凍存后復(fù)蘇的狗腎MDCK細胞-3的濃度比未胞層中隨機出現(xiàn)后，有間隙聯(lián)接存在的細胞，其相凍存的細胞平均降低了3.5倍，復(fù)蘇后6~21小時檢鄰細胞急劇出現(xiàn)冰晶的機率大大降低，而沒有間隙測到其抒發(fā)量達到高峰，在此后的培養(yǎng)36小時后恢[7][10]聯(lián)接的細胞，就無此狀況。而組織臟器的冷藏保復(fù)到凍存前的濃度，與V/PI聯(lián)染法測量存中冰晶成核與細胞間隙聯(lián)接的情況則更為復(fù)雜，到的細胞復(fù)蘇后自噬高峰的時間一致。在凍存過程這也是其成功凍存無法成功的緣由。中或復(fù)蘇培養(yǎng)后添加胱天蛋白酶抑制因子如zVAD-3.細胞自噬與冷藏損傷的關(guān)系fmk，抑制細胞自噬胱天蛋白酶介導(dǎo)的訊號通路才能傳統(tǒng)細胞凍存方式通過添加滲透性防寒劑如[10,12]改善細胞凍存復(fù)蘇后的生存率。
胱天蛋白酶抑圖1冰晶在細胞內(nèi)的擴散模式圖[4][4]冰晶首先在細胞內(nèi)隨機產(chǎn)生，其后的擴散不是隨機的。《生命的物理》2009年29卷3期·492·●OFLIFE2009，29(3)劑型zVAD-fmk才能改善多種細胞凍存后的生存率。胞，在卵母細胞的冷藏保存中，25℃低溫環(huán)境會使[11]Boon等在對人胚胎干細胞完整集落慢速冷藏的研細胞膜發(fā)生相變，反應(yīng)和HSP抒發(fā)降低，細胞通過[17]究中發(fā)覺，引起其極低復(fù)蘇率的緣由是大量的細胞細胞外途徑走上自噬導(dǎo)致凍存效率的增長。在復(fù)蘇培養(yǎng)的一段時間內(nèi)發(fā)生大量自噬。在人精液通過對轉(zhuǎn)錄水平mRNA的研究表明，高溫下細[14]凍融過程中，也存在-9被激活引起自噬的現(xiàn)胞過度抒發(fā)的應(yīng)激蛋白包括熱激蛋白和冷激蛋白，[13]象。胱天蛋白酶抑制劑zVAD-fmk可以作為一種新在不同來源的細胞中抒發(fā)發(fā)揮不同的作用，顯然這型防寒劑用于敏感細胞的冷藏保存。是不同來源的細胞在對冷藏損傷作出不同的應(yīng)激反4.細胞應(yīng)激蛋白與冷藏損傷應(yīng)，表現(xiàn)為“耐凍”或“不耐凍”的緣由之一。熱正如本文之前所提及的，細胞在凍融過程發(fā)生激蛋白(heatshock,HSP)是細胞對逆境作出壞死或自噬是其對種種不利條件作出的應(yīng)激反應(yīng)。
自我保護時須要的細胞內(nèi)分子伴侶蛋白，在所有類而在極端嚴寒條件下生存的生物如極地鰻鱺，個別型細胞中組成性抒發(fā)并高度保守，對細胞內(nèi)一些蛋動物、植物體顯存在天然的抗寒機制，在冰點以下白質(zhì)分子構(gòu)型和和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，細胞應(yīng)激、代謝、溫度時可以通過耐凍()或避凍(增殖以及自噬等生理過程均具有重要的調(diào)控作[22][15])機制來防止冰晶損傷。將其中對生物體用。HSP除了可由熱應(yīng)激誘導(dǎo)形成，也參與冷應(yīng)起冷藏保護作用的物質(zhì)加以提取細胞膜損傷，可以得到天然的激反應(yīng)。高溫下細胞HSP的抒發(fā)量有被誘導(dǎo)下調(diào)，但防寒劑，作為新型防寒劑在高溫保存方面具有一定[14,16,17]也有被抑制抒發(fā)的，與細胞在高溫下經(jīng)歷的的優(yōu)勢，其來源的開拓、作用機理的探求和生產(chǎn)技一系列損傷風(fēng)波有關(guān)，其具體機制還需進一步的研術(shù)的提升成為冷藏保護劑研究和開發(fā)的新方向。究。冷激蛋白是因細胞在低從冬眠植物在冬眠周期前通過身體對高溫環(huán)境溫環(huán)境下應(yīng)激抒發(fā)而命名的一類蛋白，其結(jié)構(gòu)保守的一系列適應(yīng)性反應(yīng)來防止高溫的傷害中得到啟性高于HSP。高溫下細胞的蛋白合成和代謝水平都[14]發(fā)，在對細胞進行凍存之前，先讓細胞接觸高于處于抑制狀態(tài)，可溶氧的濃度降低，高溫下合成37℃生理體溫的高溫環(huán)境(25℃)，誘導(dǎo)細胞對高溫的CSP的細胞應(yīng)激反應(yīng)通路被覺得與缺氧反應(yīng)時一致。
適應(yīng)性反應(yīng)，待熱激蛋白的過抒發(fā)(其中研究最多的CSP與高溫下細胞蛋白合成抑制有關(guān)，其中被廣泛是HSP70)然后再進行凍融，可作為改進復(fù)蘇效率的報導(dǎo)的Cirp和Rbm3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)高溫下[16,19][14]新途徑之一。但這一途徑并不適用于所有的細細胞的蛋白合成。圖2總結(jié)了細胞冷藏保存損傷圖2細胞冷藏保存損傷《生命的物理》2009年29卷4期●新進展·493·OFLIFE2009，29(4)的幾個方面。,5.小結(jié)2001,10:561-571[11]BoonCHetal在1950年細胞成功地實現(xiàn)冷藏保存以來，許多種凍存方式被應(yīng)用于不同來源的細胞上，而且人們發(fā)覺，細胞實現(xiàn)成功地冷藏保存并不像最初構(gòu)想的than.JSci,那樣簡單，初期細胞冷藏的研究在很大程度上是經(jīng)445[12]Setal驗性的，實際工作中許多細胞在凍存方式的改進上+CD4面臨困局，細胞存活率難以取得更大的提升，但是細胞冷藏保存的經(jīng)驗在復(fù)雜臟器組織上的應(yīng)用并不,2003,47:44-58成功。
細胞冷藏保存在人類輔助生殖中的廣泛應(yīng)用[13]Uetal使細胞冷藏損傷的反應(yīng)機制和其對胚胎后續(xù)發(fā)育的Bio,[21]影響深受關(guān)注。人們對植物細胞的基礎(chǔ)高溫生物2004,71:1828-1837學(xué)特點及冷藏機理仍須要進一步的了解。隨著上述[14]Betal問題的解決，植物細胞冷藏保存的理論和實踐將得到進一步發(fā)展。.J,2006,397:247-259[15]ASetal參考文獻&,2004,101:227-257[1]Aetal.and.AnnNYAcad[16]DBetalSci,2005,1066:119-inhuman.J,1993,[2]AckerJPetal.ofice(2):196-.,2003,46:197-202[17]AravAetal[3]AckerJPetal.Celltocellofin?MolCell,2008,after.,2000,40:54-63282(1-2):150-152[4]AckerJPetal.ice:[18]KEetforicepores.,2001,81:1389-..,2008,90(1):186-193[5]AckerJPetal.Pre-andpost-thawof[19]Metalice.J,2004,215:131-138[6]Detal.oficeinSci,2008,ofcells.,J(3-4):182-,88:647-660[20]LiXetal[7]AJetal.ofcells.,2003,46:194-,2008,17(6):1079-1085[8]BoonCHetal.Theofhuman[21]Aetcells.Appl,2005,41:97-.AnnN.Y.AcadSci[9]SunKOetal.forofhuman[22]stemcells.StemCells,2005,23:605-.AnnuRev,2001,63:327-357[10]BaustJMetal.Abasisof《生命的物理》2009年29卷3期·494·●OFLIFE2009，29(3)Theofincells:aof-(Blood,,China)tionisinfortheofcellsin;newarethatmakeuseofcellsasthebasisfor.,gene,larallrelyontheabilitytostoreandtransportcellsandtissuesinordertobesu.Thofcellsandforlongpoftimebythemhasledtoainhowandarewhentheyaretocoldtemper.Therearemanyaspectstothetocellsonthatarestill.Inthisbriefwewillofinjurytheaspectsofinjuryduringeservationthatarestill.Keyury;ice;gapj;;heatshock
