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引文
我們之前在-YFP大鼠的工作中，報導(dǎo)了甜味細(xì)胞會抒發(fā)一種奇特的對鋅離子敏感的質(zhì)子流。而本文報導(dǎo)了這個級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二個組件，一種靜息的鉀離子流，由介導(dǎo)，對胞內(nèi)的pH值超乎預(yù)料的敏感。
對嗅覺傳導(dǎo)中依賴于胞內(nèi)pH的第二組件的存在，我們有如下理論證據(jù)，一個多世紀(jì)曾經(jīng)的發(fā)覺，還能穿透細(xì)胞膜并酸化胞質(zhì)的強(qiáng)堿，比同pH的強(qiáng)堿嘗上去更酸。而在我們之前的報導(dǎo)中，甜味細(xì)胞還能在6.5-6.7的pH時被迸發(fā)出動作電位，但此時的跨膜質(zhì)子流雖然不足以極化此時的細(xì)胞。這種現(xiàn)象都可以由一個理論所解釋，即胞內(nèi)的酸化會降低甜味細(xì)胞的可迸發(fā)性。
確實有研究推論一種在甜味細(xì)胞中高抒發(fā)的單孔鉀結(jié)構(gòu)域離子通道是其胞內(nèi)pH的體會器，但沒有直接的證據(jù)證明甜味細(xì)胞會被胞內(nèi)酸化所激活。
結(jié)果
通過-YFP:Trpm5-GFP大鼠中分離到的甜味和非咸味嗅覺細(xì)胞，我們測試了甜味細(xì)胞會對胞內(nèi)酸化做出電反應(yīng)。所有細(xì)胞在接觸到鋇離子后，因為阻斷了鉀離子通道，均形成了動作電位；而在使用100mM的pH7.4的強(qiáng)酸堿液如磷酸（AA），丙酸（PA），甜味細(xì)胞會形成顯著電反應(yīng)，而非咸味嗅覺細(xì)胞則不形成電反應(yīng)；同條件的弱酸堿液，甲磺酸（MA）則均不形成電反應(yīng)。這些反應(yīng)與嗅覺細(xì)胞種類無關(guān)，CV和FL均存在。
在發(fā)覺這些關(guān)系后，我們想要找到電反應(yīng)是由哪種離子流引起的，我們之前的研究發(fā)覺在有和無強(qiáng)酸兩種的情況下，甜味細(xì)胞的鈉離子和鉀離子流無顯著區(qū)別；而在敲除大鼠中也能測量到對強(qiáng)堿的強(qiáng)反應(yīng)，故與無關(guān)；最后，在對靜息鉀離子的測量發(fā)覺外向鉀離子流不對胞外的pH減少形成反應(yīng)，卻會對20mM的乙醇形成反應(yīng)，而磷酸是還能引起胞內(nèi)酸化的，且反應(yīng)時長與強(qiáng)酸的透膜質(zhì)子運輸?shù)臅r間符合。
為了找到靜息鉀離子流的的作用分子，我們剖析了細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并篩選出了孤僻檢波鉀離子通道家族Kir和單孔鉀離子通道家族K2p的抒發(fā)。8種Kir,5種K2p有中高水平的抒發(fā)，另外還有4種K2p存在低水平的抒發(fā)，但并沒有進(jìn)一步研究。
通過抗生素篩選，我們發(fā)覺細(xì)胞對鋇離子和銫離子敏感鈉離子鉀離子通道阻滯劑，而對香豆素不敏感這一點更是將所有K2p通道排除。我們也發(fā)覺細(xì)胞對Kir1.1和3.1/3.4的抑制劑-LQ，Kir6.1和6.2的抑制劑格列本脲，Kv和KCNQ的抑制劑TEA，4-AP，均不敏感，故排除那些通道，剩下Kir2.1，2.2，4.2符合抗生素篩選。
我們通過對通道抑制動力學(xué)參數(shù)的估算可知，細(xì)胞的鉀離子流對銫離子的敏感性與Kir2.1和4.2類似，而高于Kir2.2；而對鋇離子的敏感性與Kir2.1差別較小，而與Kir2.2和4.2差別較大；在對Kir2特異抑制劑ML133的敏感性可知，Kir2.1與細(xì)胞均存在pH8.5情況下的抑制速率推進(jìn)，綜上，靜息鉀離子流出現(xiàn)的緣由是外向檢波鉀通道Kir2.1.
Kir2.1對胞內(nèi)酸化的敏感性沒有研究報導(dǎo)鈉離子鉀離子通道阻滯劑，而其他Kir和K2p通道有報導(dǎo)。我們在HEK細(xì)胞中的實驗表明異源抒發(fā)，被20mM的乙醇堿液抑制的特點與細(xì)胞類似；膜片鉗的實驗表明，細(xì)胞膜外側(cè)與堿性環(huán)境的接觸會引起快速并且部份可逆的通道活性阻斷。
為了進(jìn)一步探究三者的關(guān)系，我們建立了敲除Kir2.1的大鼠品系，但因為四肢性的敲除會促使大鼠新生致死，故將敲除限制在啟動子的限制下，實現(xiàn)細(xì)胞特異性抒發(fā)，并通過和帶有雙Flox位點的基因?qū)Φ钩视嫈?shù)，約為79%。在敲除Kir2.1的甜味細(xì)胞中測定內(nèi)流的鉀離子，發(fā)覺鉀離子流被大大降低；并且鋇離子敏感性也近乎消失，這種進(jìn)一步肯定了內(nèi)流鉀離子流與Kir2.1的關(guān)系。
我們在非咸味嗅覺細(xì)胞中也發(fā)覺有靜息鉀離子流的存在，但是會被強(qiáng)酸，鋇離子，銫離子抑制，這表明這種現(xiàn)象可能也是由Kir2.1介導(dǎo)的。我們借助由啟動子限制的Kir2.1敲除，效率約為71%。我們發(fā)覺靜息鉀流對鋇離子的敏感性被增加了，這肯定了Kir2.1的存在和作用。隨即借助胞內(nèi)pH指示劑的實驗更是證明Trpm5細(xì)胞對胞內(nèi)pH敏感而且會被強(qiáng)酸酸化胞質(zhì)。
我們隨即注意到兩種細(xì)胞鉀流的一個巨大差異，二者靜息鉀流大小的差異，非咸味細(xì)胞的鉀流是咸味細(xì)胞的7倍。為此，我們使用低含量鋇離子促使兩種細(xì)胞的鉀流處于相像水平時，非咸味細(xì)胞對pH6.6有了電反應(yīng)，形成了動作電位。故，靜息鉀流的大小決定了對強(qiáng)堿的反應(yīng)。
因為鉀流與胞內(nèi)酸化的關(guān)系，我們測定了鉀流與質(zhì)子流的關(guān)系，在pH6時，鉀流會被顯著抑制，由于這時的質(zhì)子流促使胞內(nèi)酸化；因為我們之前有報導(dǎo)這些質(zhì)子流會被鋅離子抑制，為此，我們加入鋅離子后再度測定pH6時的鉀流，發(fā)覺抑制消失，而這些差異在不對質(zhì)子流反應(yīng)的Trpm5細(xì)胞中不存在。假如單獨使用溫和的胞外酸化或則低含量磷酸均不能促使甜味細(xì)胞反應(yīng)，但二者疊加后促使細(xì)胞形成了強(qiáng)烈的電反應(yīng)。
討論
本研究與明日一研究得出的理論模型相差甚遠(yuǎn)，該模型源自斜方體后核中化學(xué)體會神經(jīng)的研究，稱質(zhì)子激活的受體GPR4與對胞外pH敏感的K2P通道一齊介導(dǎo)了覺得響應(yīng)的放大。
Kir2.1有廣泛的抒發(fā)，在腦部、心臟、血管平滑肌，骨骼肌等遍及腰部。
強(qiáng)酸更能剌激細(xì)胞可能的誘因還有強(qiáng)酸維持了氨水的pH，或則是強(qiáng)酸避免質(zhì)子被唾液蛋白吸收，而這種可能還沒有人有過研究。