多黏菌素抑菌機理及耐藥機制研究進展
來源
中國藥物刊物2019年7月第44卷第7期
作者
喬涵游雪甫李聰然
中國醫學科大學上海協和醫大學醫藥生物技術研究所
抗感染抗生素研究上海市重點實驗室
摘要
多黏菌素是臨床診治多重耐藥的革蘭陽性菌感染的最后一道防線。
但隨著多黏菌素在臨床、畜牧業及農業上使用的逐年降低以及一些藥物濫用情況的發生，造成其對革蘭陽性菌的醫治療效相對升高，出現了多種多黏菌素耐藥的革蘭陽性菌。
本文就多黏菌素的抑菌機理、副作用機制、對不同耐藥菌的耐藥機制進行綜述。
關鍵詞
革蘭陽性菌；多黏菌素耐藥；mcr-1；耐藥機制；副作用機制
正文
臨床中藥物的過度使用對真菌施加了強烈的選擇壓力，加速真菌形成藥物耐藥(nce,AMR)。
近些年來，真菌耐藥問題，非常是多黏菌素耐藥革蘭陽性菌造成的感染，越來越遭到人們的廣泛關注。
世界衛生組織的有關資料顯示，全球每年約有70千人死于藥物耐藥菌引起的感染[1]。
多黏菌素類藥物是醫治多重耐藥革蘭陽性菌感染的最后一道防線，若醫治真菌感染的最后一道防線也被真菌打破，人類將有可能步入前藥物時代。
多黏菌素于1947年被發覺，是一種古老的抗生素，價錢低廉，它是由多黏芽孢球菌形成的一組有A~E等組分的環肽類藥物[2]。
目前用于臨床的產品主要是多黏菌素B和多黏菌素E的硝酸鹽和甲磺酸鹽。
多黏菌素由線性三肽部份聯接N-脂肪硝基鏈和環狀七肽構成，4-位L-Dab(α，γ-二苯基甘氨酸)與10-位L-Thr酯化產生七肽環。
多黏菌素B和多黏菌素E的結構非常相像，僅在6-位多肽上存在差異。
多黏菌素B的6-位是D-Phe，多黏菌素E的6-位是D-Leu(圖1)[3]。
多黏菌素對大多數腸球菌科真菌有活性，包括腸球菌屬，克雷伯菌屬，葡萄柚酸弧菌屬，沙門菌屬和志賀菌屬等，對常見非發酵性革蘭陽性菌也有明顯活性，包括鮑曼不動弧菌，銅綠假單胞菌和嗜麥芽寡養單胞菌[4]。
但一些菌株對多黏菌素天然具有抗性，包括變型菌屬、摩氏摩根菌、普羅威登斯菌屬、黏質沙雷菌、馬來假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、色球菌屬、愛德華菌屬、布魯菌、軍團菌、彎曲菌和鼠疫桿菌。
多黏菌素對革蘭陽性桿菌(奈瑟桿菌屬)，革蘭陰性菌和需氧菌沒有活性[4]。由于多黏菌素抑菌譜窄，毒性大，所以最初應用于獸藥和草料添加劑。
后來隨著碳青霉烯類藥物耐藥菌的形成，多黏菌素也開始慢慢應用于臨床診治，并被譽為臨床診治多重耐藥革蘭陽性菌感染的最后一道防線。
隨著多黏菌素應用的增多，有些真菌對其形成了耐藥性，而多黏菌素耐藥機制也成為了研究熱點。
多黏菌素耐藥的完整機制仍未完全闡述，但多黏菌素耐藥現象的出現很可能與服藥時間的延長及用用量的加強有關。
本文將從多黏菌素的抑菌機理、副作用形成機制、耐藥機制等方面進行綜述和討論。
內容由凡默谷小編查閱文獻選定，排版與編輯為原創。如轉載，請尊重勞動成果，標明來始于凡默谷公眾號。
多黏菌素抑菌作用機制
革蘭陽性病菌外膜(outer,OM)的關鍵作用是作為滲透屏障[6]。
多黏菌素的原始靶標是外膜上的脂寡糖(,LPS)組分。
LPS由3個結構域組成，即脂類A、核心黃酮和O-抗體。
脂類A充當疏水端，脂肪硝基鏈的緊密堆積有助于穩定整個外膜的結構[7]。
多黏菌素通過與LPS的脂類A組分互相作用使病菌外膜私密性降低(圖2)來發揮它們的抑菌作用。
多黏菌素的抑菌譜之所以窄，也是由于其只能與有限幾種LPS結合引起[6,8-9]。
盡管LPS是最初的靶標，但多黏菌素的準確作用形式仍舊不清楚，目前已知的機制有以下幾種。
1.1“自促攝入”機制
該機制是一個被廣為認可的模型，該模型覺得多黏菌素兩性性質對多黏菌素分子通過外膜屏障至關重要。
在這個模型中，多黏菌素Dab殘基上游離的羥基在生理條件下發生質子化作用，并與類質A乙酸基陰離子(圖3)形成靜電吸引作用。
質子化的多黏菌素代替二價陽離子(Mg2+和Ca2+)來穩定脂寡糖層，多黏菌素分子的N-脂肪硝基鏈和6、7位疏水部份的插入，弱化了相鄰脂類A脂肪硝基鏈的堆積，造成外膜雙層的擴充，最終使外膜膨脹[10-11]。
此后，多黏菌素介導的外膜和細胞膜融合通過誘導磷脂交換實現，最終引致滲透失衡和細胞死亡[5]。
1.2多黏菌素介導的內膜和外膜的囊泡之間的接觸
這一假定是基于多黏菌素B結合于陰離子磷脂囊泡，才能產生囊泡-囊泡接觸的實驗結果[11-12]。
這種接觸才能促使囊泡之間的磷脂交換。
在革蘭陽性菌中，多黏菌素B在周質空間中可以產生內膜和外膜之間的接觸和脂類交換，而內外膜都含有磷脂酰甘油和心磷脂，由此形成的磷脂交換會增加其成份的差別細胞膜選擇性通透，因而造成細胞滲透不平衡和細胞活力的失去[12]。
1.3抑制真菌內膜中重要的呼吸酶
通常來說真菌呼吸鏈由3個復合體組成，醌和還原型輔酶(NADH)作為在大蛋白質復合物之間穿梭電子和質子的載體來發揮作用[13]。
在復合物1中，已鑒別出NADH氧化酶家族的3種內膜呼吸酶：NDH-1、NDH-2和鈉轉運NADH-Q氧化還原酶[13-14]。
多黏菌素通過甲基自由基的釋放含量依賴性地抑制革蘭陽性菌內膜中NDH-2酶活性，從而誘導鮑曼不動鏈球菌和其他革蘭陽性菌的快速殺滅[15]。
1.4抗內毒素作用
除直接抑菌活性外，多黏菌素還具有有效的抗內毒素活性。
革蘭陽性病菌的內毒素是LPS分子的脂類A。
多黏菌素B結合并中和LPS的脂類A，阻斷了LPS和完整細胞在孵育后誘導內毒素暈厥介質癌癥壞死因子(TNF)的能力，進而有效保護了被革蘭陽性菌所感染的寄主[16-17]。
多黏菌素的副作用機制
盡管多黏菌素對個別耐藥的革蘭陽性菌感染有著突出且不可取代的作用，但由于多黏菌素抑菌譜窄，毒性大等問題還是不能成為一個很理想的抗生素。
隨著碳青霉烯類藥物耐藥菌的形成，多黏菌素不得不成為對抗多重耐藥的革蘭陽性菌的最后一道防線，但其明顯的副作用包括神經毒性和腎毒性也是不可忽略的問題。
為此，多黏菌素臨床使用時形成副作用的相死機制很有必要進行了解和闡述。
2.1神經毒性
神經毒性表現為腹痛、嗜睡、面部和周圍組織覺得異常、眩暈、視力增長、共濟失調和神經胸肌接頭阻滯，可能造成呼吸衰竭或呼吸暫停，神經毒性是劑量依賴性和可逆性的。
分子伴侶HSP90是活細胞中必不可少的蛋白質之一[18-19]。
黏菌素對HSP90的ATP酶活性沒有影響，且低含量不影響HSP90的分子伴侶活性[20]，但黏菌素可特異性結合HSP90，通過N-端結構域誘導HSP90集聚，故學者們猜想神經毒性是因為腦部中高含量的黏菌素與HSP90的集聚，致使HSP90的失活，而HSP90的失活可能造成細胞功能的崩潰，而且可以間接誘導細胞自噬。
2.2腎毒性
腎毒性是最常見的不良反應，非常是對于新推薦的高劑量醫治方案。
腎毒性主要包括急性腎小管壞死，表現為膽紅素消除率增加，血漿尿素和尿酸水平下降。
與神經毒性類似，腎毒性也是劑量依賴型的，且在初期停藥病癥可逆。
黏菌素的腎毒性主要與其D-胺基乙酸和脂肪酸成份有關，腎毒性機制類似于它的抑菌作用：
(1)細胞膜毒性：黏菌素降低了腎小管上皮細胞膜的私密性，致使陽離子、陰離子和水分流入，導致細胞水腫和細胞溶化[21]。
(2)氧化應激損傷：指機體在須要消除體內老化的細胞，或在遭遇各類有害剌激時，體內高活性分子，如活性氧自由基(ROS)和活性氮(RNS)自由基形成過多，氧化程度超出氧化物的清理，氧化系統和抗氧化系統失衡，因而造成組織損傷[22]。維生素C、褪黑素及N-甲基半胱谷氨酸等抗氧化劑可保護黏菌素誘發的腎細胞脂類二溴化及自噬等副作用發生[23]。
(3)細胞自噬途徑(即線粒體，死亡受體和葉綠體途徑)和凋亡途徑：植物及體外細胞模型研究否認，線粒體自噬通路、內質網自噬通路及死亡受體自噬通路參與黏菌素誘導的細胞自噬，且線粒體及死亡受體通路為黏菌素誘導細胞自噬的主要通路[24-25]。
(4)另外，黏菌素還可能通過抑制寄主核質和內質網體的功能糖體功能形成腎毒性。
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2.3其他毒性
黏菌素的其他不良反應包括過敏反應、皮疹、報道，黏菌素導致的過敏反應發生率約為2%[26]。
據悉，偽膜性結腸癌代表了黏菌素的另一副作用，雖然罕見，但也是黏菌素醫治的潛在副作用。使用霧化黏菌素醫治可能進一步加重支食道收縮和頭暈。
但是，在開始用霧化黏菌素醫治之前吸入β2興奮劑診治可以防治支食道收縮的發展。
腦室內給與黏菌素，非常是高劑量，可能造成敗血癥。但這種不良反應大多比較稀少，故其發生機制還有待研究。
多黏菌素耐藥機制
隨著多黏菌素耐藥現象的出現和降低，耐藥機制的研究已成為目前的一項熱點問題。
多黏菌素耐藥的完整機制仍未完全闡述，目前已明晰的主要有以下4種[27]：對外膜脂寡糖(LPS)結構進行修飾整修；屏障系統或低毒外排泵系統的活化；存在抗生素的降解蛋白；真菌的異質性耐藥等[11,28-29]。
3.1對外膜脂寡糖(LPS)結構進行修飾改建
多黏菌素對革蘭陽性菌作用的關鍵第一步是多黏菌素帶正電的α,γ-二羥基乙酸(Dab)殘基和脂類A上的帶負電荷的乙酸官能團之間的靜電互相作用[3,5]。
為此，許多真菌對多黏菌素耐藥的機制是基于減少這些初始靜電互相作用的脂類A背部官能團的修飾。
在大腸埃希菌、沙門菌血漿型鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌中，用帶正電荷的官能團，比如4-甲基-4-脫氧-L-阿拉伯糖和/或乙酸乙酸胺修飾脂類A的乙酸鹽，可降低凈負電荷量而介導弧菌的多黏菌素耐藥性(圖4)。
這些修飾脂類A的機制又分為引物蕁流感、全身性濕疹、發燒和重度腸道道疾患。據介導和染色體介導兩種。
3.1.1引物介導的多黏菌素耐藥機制
過去覺得，黏菌素的耐藥機制是由染色體突變介導，并不能通過基因的水平轉移導致耐藥，但2015年首次在植物源大腸埃希菌(coli)中發覺了引物介導的黏菌素耐藥基因mcr-1()[30]，并通過體外接合試驗證明了該基因可通過可接合性質粒在不同菌株間傳播，介導低水平的黏菌素耐藥。
mcr-1基因全長，GC濃度49%，坐落IncI2型引物上。
產物MCR-1蛋白寬度為541個多肽。
多肽序列剖析結果顯示MCR-1與之前報導的乙酸乙酸胺轉移酶家族有60%左右的相像性，與類芽孢球菌編碼的乙酸乙酸胺轉移酶的同源性達63%[30]。
乙酸乙酸胺轉移酶可將乙酸乙酸胺官能團(PEtN)添加到脂寡糖表面的類脂A上，進而增加黏菌素與脂寡糖的靜電作用，造成真菌對黏菌素耐藥[31-32]。
通過ESI-MS剖析，否認MCR-1具有乙酸甲醇胺轉移酶活性，即可催化乙酸乙酸胺與脂寡糖表面類脂A結合，介導黏菌素耐藥[30]。
通過對MCR-1蛋白模擬結構剖析，MCR-1蛋白是一個膜結合蛋白，N端為膜結合域，富含5個疏水的跨膜α-螺旋結構，C端為親水結構域。
跨膜結構域能固定MCR-1于細胞內膜的周質面，在細胞周質中完成對類脂A的共價修飾，同時強調MCR-1中的5個多肽殘基(E246、T285、H395、D465和H466)可能與其底物結合活性相關[33]。
MCR-1與兩個已知的可溶乙酸乙酸轉移酶結構(圖5)相像，分別為顳葉炎奈瑟菌的LptA和空腸彎曲弧菌的EptC[30]。
除mcr-1外，2016年6月在德國大腸埃希菌中鑒別出一種新型引物介導的黏菌素抗性基因mcr-2[34]。
mcr-2基因長，比mcr-1短9個核苷酸，與mcr-1具有76.75%的同源性。
MCR-1和MCR-2蛋白顯示80.65%的同源性。
2017年4月，第三個聯通黏菌素抗性基因mcr-3被發覺[35]。
mcr-3基因全長，分別與mcr-1和mcr-2顯示45.0%和47.0%的堿基序列同源性。
MCR-3的多肽序列分別與MCR-1和MCR-2具有32.5%和31.7%的多肽同源性。
2017年在mcr-3發覺不久，mcr-4也被發覺，其基因全長[36]。
2017年12月，有被稱為mcr-5()的基因被發覺[37]，它是Tn3家族的轉座子的一部份，但是一般坐落相關的多拷貝ColE型引物上。
mcr-5與mcr-1和mcr-2有81.23%的多肽序列同源性而且被覺得都起源于莫拉菌屬。
而MCR-5與MCR-1、MCR-2、MCR-3和MCR-4的蛋白質序列同源性分別為36.11%、35.29%、34.72%和33.71%[37]。
內容由凡默谷小編查閱文獻選定，排版與編輯為原創。如轉載，請尊重勞動成果，標明來始于凡默谷公眾號。
3.1.2染色體介導的多黏菌素耐藥機制
對于奇特變型菌和黏質沙雷菌，對多黏菌素的天然耐藥與乙酸乙酸胺(pEtN)或4-羥基阿拉伯糖(L-Ara4N)陽離子絡合物修飾LPS的脂類A有關。
這些修飾降低了多黏菌素初始靶標LPS的電荷，因而增加了多黏菌素的結合，造成這種菌種的固有耐藥[38-40]。
對于腸球菌科真菌，也是向LPS添加陽離子絡合物(如L-Ara4N和pEtN)，與其有關的基因包括編碼直接參與LPS修飾的酶基因和操縱子(負責合成陽離子絡合物和/或將其添加到LPS)。如：
(1)pmrC基因：操縱子編碼3種蛋白質，即乙酸乙酸胺轉移酶PmrC，反應調節劑PmrA(俗稱為BasR)和傳感激酶蛋白PmrB(俗稱為BasS)[41]。
(2)pmrE基因和操縱子(俗稱或pbgPE操縱子)：負責L-胺基阿拉伯糖絡合物(L-Ara4N)的合成及其對脂類A的固定[42]。
(3)pmrA和pmrB基因：PmrB是具有絲氨酸激酶活性的蛋白質，其通過乙酸化來激活PmrA。PmrA依次激活參與LPS修飾的操縱子，操縱子和pmrE基因的轉錄[41]。
(4)phoP和phoQ基因：PhoQ是一種具有絲氨酸激酶活性的蛋白質，通過乙酸化活化PhoP。PhoP反過來激活操縱子的轉錄，參與將L-Ara4N添加到LPS的脂類A上[43-44]。PhoP也可以通過PmrD聯接蛋白直接或間接激活PmrA蛋白，造成pEtN添加到LPS中。
(5)mgrB基因：MgrB(亦稱為YobG)是47個多肽的小跨膜蛋白。PhoP激活后，mgrB基因下調。MgrB蛋白抑制PhoQ編碼基因的抒發，因而MgrB蛋白對phoPQ操縱子有負反饋作用。而mgrB基因的失活造成phoPQ操縱子的過抒發，從而導致操縱子活化，造成L-Ara4N修飾LPS作用而形成耐藥[45-46]。
(6)crrAB操縱子：crrAB操縱子編碼兩種蛋白質，調節蛋白CrrA和傳感蛋白激酶CrrB。crrB基因的失活造成pmrAB操縱子的過抒發，進而造成操縱子及pmrC和pmrE基因的激活，最終造成真菌獲得黏菌素耐藥性。CrrB失活也可能通過激活糖基轉移酶樣蛋白來修飾脂類A[47-48]。
(7)ParRS、ColRS和CprRS3種雙組分體系：ParRS(多黏菌素適應性耐藥)雙組分體系與多黏菌素的適應性耐藥有關[49]。
該系統突變引起操縱子的組成形抒發細胞膜選擇性通透，并因而造成L-Ara4N添加至LPS造成黏菌素耐藥。
ColRS和CprRS系統的作用可能通過激活phoQ基因或通過其他基因造成黏菌素耐藥[50]。
3.2屏障系統改變或低毒外排泵系統的活化
除對LPS的修飾作用外，還有一些其他機制，如：
(1)莢膜寡糖(CPS)形成降低：一項研究表明，CPS可作為淋病克雷伯菌抗多黏菌素的保護屏障[51]，CPS在真菌表面釋放陰離子，這種陰離子與多黏菌素結合，進而降低多黏菌素與LPS的結合，使病菌菌體遭到保護[52]，形成多黏菌素耐藥。
(2)內在調節器RamA：它調節與滲透性障礙相關的基因，因而可能參與減少對藥物的易感性。這些調節因子水平的下降導致LPS的改變，進而增加了對多黏菌素的易感性[53]。
(3)膜孔蛋白的作用：ydeI基因編碼14kDa的多肽/寡核酸結合折疊蛋白(OB-折疊蛋白)，這些OB-折疊蛋白可與膜孔蛋白(OmpD/NmpC：三聚體β-折疊外膜孔蛋白家族成員)互相作用進而降低真菌對多黏菌素的抗性，如肝臟沙門菌對多黏菌素的抗性[54]。
(4)外排泵的作用：外排泵的編碼組分kpnEF和acrAB的突變可造成黏菌素MIC明顯增加[55-56]。在低劑量外排泵抑制劑甲基溴化間甲苯腙(CCCP)中培養耐藥菌，可減少耐藥弧菌的MIC(降低128~512倍)，并部份或完全抑制抗性亞群的再生[57]。
(5)脂類A生物合成基因(lpxA、lpxC和lpxD基因)改變：這種基因可能被插入序列如所替換、截斷、移碼或插入失活，導致的LPS完全失去，最終造成多黏菌素耐藥[58-59]。
3.3存在抗生素的降解蛋白
乘以上機制外，還有一種直接的耐藥機制，就是真菌還能形成降解多黏菌素的酶，進而降解多黏菌素，使其不能與真菌的脂類A互相作用。
因為多黏菌素本身屬于一種氨基酸類藥物，因而才能將其降解的也應是蛋白酶。2018年學者們從若干蛋白酶形成菌中篩選得到高效降解黏菌素的地衣芽孢球菌DC-01[60]。
該菌種可在23~44℃之間形成黏菌素降解酶，但因為未做進一步確證，還不知編碼該蛋白酶的基因坐落引物還是染色體中，但仍應當提升提防以防一些革蘭陽性菌獲得生產該酶的能力因而導致黏菌素耐藥。
3.4真菌的異質性耐藥
異質性耐藥是真菌耐藥的一種特殊類型，說的是一種表面上同源的真菌，表現出對特定藥物部份敏感的現象[61]，即在體外的常規藥敏試驗中，弧菌表現為敏感，倘若改用特殊方式測量，則可以發覺細胞的大部份亞群屬于敏感，但有一小部份亞群屬于耐藥，極少數亞群甚至表現為高水平耐藥，這部份耐藥亞群可以造成臨床藥物醫治失敗[62]。
(1)鮑曼不動球菌對黏菌素異質性耐藥的機制可能與LPS或/和PmrAB雙組分系統的失去有關[63]。
(2)芹菜伯克霍爾德菌對多黏菌素B的異質性耐藥取決于硫酸二丁胺分泌水平和YceI的不同。因為硫酸二丁胺具有揮發性，因而也可以以揮發性介導的形式將抗性傳遞給數學分離的真菌[64]。
(3)銅綠假單胞菌對多黏菌素的異質性耐藥也與多胺有關[65]。
總結與展望
多黏菌素到目前為止還是臨床診治多重耐藥革蘭陽性菌感染的最后一道防線。
因而探求多黏菌素的作用機制和副作用機制，以開發愈發有效且副作用更小的多黏菌素類似物；探求多黏菌素的耐藥機制，以發覺更有效的對抗耐藥的靶向都是極為必要的。
本文中論述的機制希望可以對臨床診治和基礎探究以及對抗多黏菌素耐藥起到部份指導作用。
參考文獻
詳見中國藥物刊物2019年7月第44卷第7期