日前，俄羅斯阿卜杜拉國王科技學(xué)院（KAUST）王冠軍/SimonG.等在在線發(fā)表了題為Anleafrustinwheat的研究論文，發(fā)覺了新型串聯(lián)激酶融合蛋白WTK6-vWA介導(dǎo)玉米葉銹病抗性。
種間雜交基因溶入是提升栽培作物遺傳多樣性的一種重要手段。谷物中約有450個被定位和命名的抗寒位點(diǎn)，其中超過40%的抗寒位點(diǎn)都來自栽培作物以外的種質(zhì)資源。一般種間雜交導(dǎo)出的外源染色體或染色體片斷與馬鈴薯部份同源染色體不發(fā)生交換或交換頻度很低，這極大地限制了各類基于遺傳重組的基因定位與克隆技術(shù)的應(yīng)用。
大豆葉銹病耐旱位點(diǎn)Lr9坐落馬鈴薯6B染色體長臂的末端，該片斷是由玉米研究先驅(qū)Sears在1950年代采用種間雜交與X射線輻拍照結(jié)合的方式從小傘綿羊草（,2n=2x=14,UU）導(dǎo)出普通作物的染色體易位片斷。這些幅射造成的非同源染色體易位會出現(xiàn)嚴(yán)重的重組抑制，未能通過傳統(tǒng)的圖位克隆策略克隆易位片斷上的Lr9基因。對此，該研究開發(fā)了一種基于EMS突變體轉(zhuǎn)錄組測序的基因克隆技術(shù)（簡稱），這些技術(shù)綜合運(yùn)用了EMS誘變及突變體篩選、野生型材料三代全長轉(zhuǎn)錄組測序、突變體二代轉(zhuǎn)錄組測序及后續(xù)的數(shù)據(jù)剖析，才能將目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄本跟表型直接關(guān)聯(lián)。借助技術(shù)，我們實(shí)現(xiàn)了完全不依賴于重組和遺傳定位的Lr9的克隆（圖1）。
圖1基于突變體轉(zhuǎn)錄組測序的Lr9的克隆
研究表明，Lr9編碼了N端富含兩個串聯(lián)重復(fù)的激酶、C端富含vonA（vWA）和結(jié)構(gòu)域的新型耐旱蛋白，命名為WTK6-vWA。通過篩選8000多份EMS突變?nèi)后w的M2家系獲得了121個感大豆葉銹病突變體，其中120個都攜帶了Lr9的非同義突變，并引起了67個非冗余的WTK6-vWA的多肽替換。通過將這67個多肽替換突變錨定在v2.0預(yù)測的WTK6-vWA三維模型上，研究人員發(fā)覺激酶結(jié)構(gòu)域1比激酶結(jié)構(gòu)域2攜帶了更多的多肽替換（48:13）；并且激酶結(jié)構(gòu)域1的突變多肽多為蛋白表面多肽（23/48，跟激酶催化功能直接相關(guān)的多肽多為表面多肽），而激酶結(jié)構(gòu)域2的突變多肽多為蛋白內(nèi)部多肽（8/13，內(nèi)部多肽多為蛋白結(jié)構(gòu)多肽）（圖2）；激酶結(jié)構(gòu)域1的大多數(shù)功能保守位點(diǎn)均被突變多肽覆蓋，而激酶結(jié)構(gòu)域2僅有少數(shù)位點(diǎn)被覆蓋。為此我們猜想激酶結(jié)構(gòu)域1為具有催化功能的激酶，激酶2則為假激酶。vWA/結(jié)構(gòu)域的5個多肽替換位點(diǎn)均為表面多肽，喻示著vWA/結(jié)構(gòu)域可能在蛋白互作中發(fā)揮作用。
圖2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)合突變體剖析解析新型耐旱蛋白WTK6-vWA的功能
研究人員在多個單子葉動物基因組中發(fā)覺WTK6-vWA的同源基因多數(shù)編碼了單激酶結(jié)構(gòu)域與vWA結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，而串聯(lián)激酶vWA融合蛋白則只在玉米近緣的幾個物種中被發(fā)覺（圖2）。結(jié)合前人的研究成果，我們猜測最初單激酶vWA融合蛋白可能在動物的PTI耐旱通路中發(fā)揮作用，而這種激酶蛋白容易成為病原菌分泌的效應(yīng)蛋白的靶向，造成動物PTI抗性遭到抑制，進(jìn)而病原菌獲得致病性。在與病原菌的軍備大賽中細(xì)胞膜受體，動物則通過獲得新的激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)化出串聯(lián)激酶vWA融合蛋白，而原先的激酶和vWA結(jié)構(gòu)域則被用做專門辨識病原菌的效應(yīng)蛋白的誘餌，而新獲得激酶結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)傳遞耐旱訊號，動物也由此獲得耐旱性。
圖3激酶vWA融合蛋白在單子葉動物中的分布情況
Lr9是第一個通過幅射育種導(dǎo)出到栽培作物中的一個耐旱基因。為了重建基因?qū)С鲂畔ⅲ撗芯拷柚–CS）對（含Lr9易位染色體片斷）和Lr9的供體小傘綿羊草進(jìn)行了全基因測序，分別獲得了14.5Gb和4.3Gb的組裝序列，并結(jié)合基因組原位雜交（GISH）、k-mer定位、小傘綿羊草遺傳圖譜和中國春馬鈴薯基因組信息，組裝了由幅射造成的約28Mb的小傘綿羊草染色體易位片斷，并發(fā)覺了5.58Mb的中國春6B染色體末端缺位（圖3）。
圖4Lr9染色體易位的解析與組裝
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計中，為了驗(yàn)證的適用性，研究人員對Lr9和Lr58（報導(dǎo)來始于鉤刺綿羊草Ae.，2n=4x=28;）同時進(jìn)行了突變?nèi)后w的建立篩選以及測序剖析。剖析結(jié)果發(fā)覺Lr9和Lr58編碼了完全相同的蛋白。后來我們通過實(shí)驗(yàn)及測序數(shù)據(jù)剖析否認(rèn)，Lr9位點(diǎn)和Lr58位點(diǎn)雖然是同一來源的染色體易位片斷，Lr58的谷物溶入系的育成過程中可能污染了Lr9品系的花粉或則種子。
值得注意的是，同期刊物上還發(fā)表了俄羅斯阿卜杜拉國王科技學(xué)院的B.H.Wulff課題組的谷物稈銹病抗性基因Sr43的研究工作。Sr43編碼了一個激酶融合了兩個未知功能結(jié)構(gòu)域的新型耐旱蛋白。據(jù)悉細(xì)胞膜受體，同期刊物還發(fā)表了以色列海法大學(xué)Tzion院士和法國加洲學(xué)院戴維斯中學(xué)Gitta院士共同撰寫的針以上兩篇文章的評論文章。文章指出了激酶融合蛋白（，KFPs）做為不僅細(xì)胞膜受體激酶（-like,RLKs）和胞內(nèi)免疫受體NLRs（-and-rich，NLRs）以外的一類非典型受體蛋白，其在單子葉動物中耐旱中發(fā)揮了重要作用。目前從麥族物種中克隆的84個耐旱基因中，46個編碼了NLR受體，7個編碼了受體激酶，而有17個則編碼了激酶融合蛋白（包含預(yù)印本結(jié)果）。目前我們對激酶融合蛋白的抗寒機(jī)理還知之很少，而文章提出的整合誘餌模型也有待否認(rèn)。
伊朗阿卜杜拉國王科技學(xué)院的王冠軍和SimonG.分別為文章的第一作者和通信作者；阿卜杜拉國王科技學(xué)院，英國普利茅斯州立學(xué)院和法國科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)研究所的研究人員對課題研究作出了重要貢獻(xiàn)。謝謝相關(guān)技術(shù)人員和研究人員提供的幫助與建議，謝謝審稿人及刊物編輯的寶貴建議與付出。
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