日前，俄羅斯阿卜杜拉國王科技學院（KAUST）王冠軍/SimonG.等在在線發表了題為Anleafrustinwheat的研究論文，發覺了新型串聯激酶融合蛋白WTK6-vWA介導玉米葉銹病抗性。
種間雜交基因溶入是提升栽培作物遺傳多樣性的一種重要手段。谷物中約有450個被定位和命名的抗寒位點，其中超過40%的抗寒位點都來自栽培作物以外的種質資源。一般種間雜交導出的外源染色體或染色體片斷與馬鈴薯部份同源染色體不發生交換或交換頻度很低，這極大地限制了各類基于遺傳重組的基因定位與克隆技術的應用。
大豆葉銹病耐旱位點Lr9坐落馬鈴薯6B染色體長臂的末端，該片斷是由玉米研究先驅Sears在1950年代采用種間雜交與X射線輻拍照結合的方式從小傘綿羊草（,2n=2x=14,UU）導出普通作物的染色體易位片斷。這些幅射造成的非同源染色體易位會出現嚴重的重組抑制，未能通過傳統的圖位克隆策略克隆易位片斷上的Lr9基因。對此，該研究開發了一種基于EMS突變體轉錄組測序的基因克隆技術（簡稱），這些技術綜合運用了EMS誘變及突變體篩選、野生型材料三代全長轉錄組測序、突變體二代轉錄組測序及后續的數據剖析，才能將目標基因的轉錄本跟表型直接關聯。借助技術，我們實現了完全不依賴于重組和遺傳定位的Lr9的克隆（圖1）。
圖1基于突變體轉錄組測序的Lr9的克隆
研究表明，Lr9編碼了N端富含兩個串聯重復的激酶、C端富含vonA（vWA）和結構域的新型耐旱蛋白，命名為WTK6-vWA。通過篩選8000多份EMS突變群體的M2家系獲得了121個感大豆葉銹病突變體，其中120個都攜帶了Lr9的非同義突變，并引起了67個非冗余的WTK6-vWA的多肽替換。通過將這67個多肽替換突變錨定在v2.0預測的WTK6-vWA三維模型上，研究人員發覺激酶結構域1比激酶結構域2攜帶了更多的多肽替換（48:13）；并且激酶結構域1的突變多肽多為蛋白表面多肽（23/48，跟激酶催化功能直接相關的多肽多為表面多肽），而激酶結構域2的突變多肽多為蛋白內部多肽（8/13，內部多肽多為蛋白結構多肽）（圖2）；激酶結構域1的大多數功能保守位點均被突變多肽覆蓋，而激酶結構域2僅有少數位點被覆蓋。為此我們猜想激酶結構域1為具有催化功能的激酶，激酶2則為假激酶。vWA/結構域的5個多肽替換位點均為表面多肽，喻示著vWA/結構域可能在蛋白互作中發揮作用。
圖2蛋白結構預測結合突變體剖析解析新型耐旱蛋白WTK6-vWA的功能
研究人員在多個單子葉動物基因組中發覺WTK6-vWA的同源基因多數編碼了單激酶結構域與vWA結構域的融合蛋白，而串聯激酶vWA融合蛋白則只在玉米近緣的幾個物種中被發覺（圖2）。結合前人的研究成果，我們猜測最初單激酶vWA融合蛋白可能在動物的PTI耐旱通路中發揮作用，而這種激酶蛋白容易成為病原菌分泌的效應蛋白的靶向，造成動物PTI抗性遭到抑制，進而病原菌獲得致病性。在與病原菌的軍備大賽中細胞膜受體，動物則通過獲得新的激酶結構域進化出串聯激酶vWA融合蛋白，而原先的激酶和vWA結構域則被用做專門辨識病原菌的效應蛋白的誘餌，而新獲得激酶結構域則負責傳遞耐旱訊號，動物也由此獲得耐旱性。
圖3激酶vWA融合蛋白在單子葉動物中的分布情況
Lr9是第一個通過幅射育種導出到栽培作物中的一個耐旱基因。為了重建基因導出信息，該研究借助（CCS）對（含Lr9易位染色體片斷）和Lr9的供體小傘綿羊草進行了全基因測序，分別獲得了14.5Gb和4.3Gb的組裝序列，并結合基因組原位雜交（GISH）、k-mer定位、小傘綿羊草遺傳圖譜和中國春馬鈴薯基因組信息，組裝了由幅射造成的約28Mb的小傘綿羊草染色體易位片斷，并發覺了5.58Mb的中國春6B染色體末端缺位（圖3）。
圖4Lr9染色體易位的解析與組裝
在實驗設計中，為了驗證的適用性，研究人員對Lr9和Lr58（報導來始于鉤刺綿羊草Ae.，2n=4x=28;）同時進行了突變群體的建立篩選以及測序剖析。剖析結果發覺Lr9和Lr58編碼了完全相同的蛋白。后來我們通過實驗及測序數據剖析否認，Lr9位點和Lr58位點雖然是同一來源的染色體易位片斷，Lr58的谷物溶入系的育成過程中可能污染了Lr9品系的花粉或則種子。
值得注意的是，同期刊物上還發表了俄羅斯阿卜杜拉國王科技學院的B.H.Wulff課題組的谷物稈銹病抗性基因Sr43的研究工作。Sr43編碼了一個激酶融合了兩個未知功能結構域的新型耐旱蛋白。據悉細胞膜受體，同期刊物還發表了以色列海法大學Tzion院士和法國加洲學院戴維斯中學Gitta院士共同撰寫的針以上兩篇文章的評論文章。文章指出了激酶融合蛋白（，KFPs）做為不僅細胞膜受體激酶（-like,RLKs）和胞內免疫受體NLRs（-and-rich，NLRs）以外的一類非典型受體蛋白，其在單子葉動物中耐旱中發揮了重要作用。目前從麥族物種中克隆的84個耐旱基因中，46個編碼了NLR受體，7個編碼了受體激酶，而有17個則編碼了激酶融合蛋白（包含預印本結果）。目前我們對激酶融合蛋白的抗寒機理還知之很少，而文章提出的整合誘餌模型也有待否認。
伊朗阿卜杜拉國王科技學院的王冠軍和SimonG.分別為文章的第一作者和通信作者；阿卜杜拉國王科技學院，英國普利茅斯州立學院和法國科大學實驗動物學研究所的研究人員對課題研究作出了重要貢獻。謝謝相關技術人員和研究人員提供的幫助與建議，謝謝審稿人及刊物編輯的寶貴建議與付出。
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