對(duì)于干式物鏡，介質(zhì)為空氣，透鏡開口比一般為0.05~0.95； 油鏡片以雪松油為介質(zhì)，鏡片開口率可接近1.5。 普通光的波長為400~700nm，因此顯微鏡的分辨率值不會(huì)低于0.2μm。 人眼的分辨率為0.2mm，因此一般顯微鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)通常為1000X。 （2）熒光顯微鏡 圖2-2 Nikon E800熒光DIC顯微鏡 細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)，如葉綠素，受到紫外線照射后會(huì)發(fā)出熒光； 其他物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，在紫外線照射下也能發(fā)出熒光。 熒光顯微鏡（圖2-2、3、4）是對(duì)該類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。 圖 2-3 落射照明原理 熒光顯微鏡與普通顯微鏡有以下區(qū)別： 1、照明方式通常為落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上（圖 2-3 ）； 2、光源為紫外光，波長比普通顯微鏡更短，分辨率更高； 3、有兩片特殊濾光片，光源前面的一片用于濾除可見光，目鏡與物鏡之間的一片用于濾除紫外線，保護(hù)人眼。 圖2-4 熒光顯微鏡照片（微管為綠色，微絲為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色），圖片來自（3），激光共焦掃描顯微鏡 圖2-5 激光共焦掃描顯微鏡 圖2-6 LCSM照片，藍(lán)色是細(xì)胞核，綠色是微管。 圖片來自激光共焦掃描顯微鏡（圖2-5、6）。 采用激光作為掃描光源，逐點(diǎn)、逐線、逐面快速掃描成像。 收集掃描激光和熒光。 共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)是掃描激光的焦點(diǎn)，也是瞬間成像的物點(diǎn)。
由于激光束的波長較短且光束很細(xì)，因此共焦激光掃描顯微鏡具有較高的分辨率，約為普通光學(xué)顯微鏡的三倍。 系統(tǒng)聚焦一次后，掃描僅限于樣品的一個(gè)平面。 當(dāng)聚焦深度不同時(shí)，可以獲得樣品不同深度級(jí)別的圖像。 這些圖像信息存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。 通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，可以顯示細(xì)胞樣品的三維結(jié)構(gòu)。 激光共聚焦掃描顯微鏡不僅可用于觀察細(xì)胞形態(tài)，還可用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)、細(xì)胞形態(tài)測量等。 (4)暗視野顯微鏡：暗視野顯微鏡的聚光鏡中心有一塊光板(圖2-7)，使照明光不直接進(jìn)入人的晶狀體，只有反射的光被標(biāo)本衍射的光被允許進(jìn)入物鏡，因此視場的背景是黑色的，物體的邊緣是明亮的。 使用這種顯微鏡，可以看到小至4至200nm的顆粒，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。 圖2-7 暗視場照明法（5）、相差顯微鏡 相差顯微鏡（ope，圖2-8、9）是由P.設(shè)計(jì)的，于1932年發(fā)明，并因此獲得1953年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。 這種顯微鏡的最大特點(diǎn)是可以觀察未染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。 相差顯微鏡的基本原理是將可見光透過標(biāo)本的光程差轉(zhuǎn)化為振幅差，從而提高各種結(jié)構(gòu)之間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)清晰可見。
光線穿過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離原來的光路，并被延遲1/4λ（波長）。 如果增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光束合并后發(fā)生干涉。 加強(qiáng)、增加或減少振幅、增加對(duì)比度。 從結(jié)構(gòu)上看，相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡有兩個(gè)特殊之處： 1、環(huán)形光闌（？）位于光源和聚光鏡之間，其作用是與光線形成一個(gè)空心光錐。通過冷凝器。 專注于樣本。 2、相位板（） 在物鏡上添加了涂有氟化鎂的相位板，可以使直射光或衍射光的相位延遲1/4λ。 它分為兩種：(1)． A+相位板：直射光延遲1/4λ。 兩組光波結(jié)合后，光波相加，振幅增大。 標(biāo)本結(jié)構(gòu)變得比周圍介質(zhì)更亮，形成明亮對(duì)比度（或稱為負(fù)對(duì)比度）。 (2).B+相位板：使衍射光延遲1/4λ。 兩組光線組合后，光波相減，振幅變小，形成暗對(duì)比（或正對(duì)比），結(jié)構(gòu)變得比周圍介質(zhì)更暗。 圖2-8 相差顯微鏡的照明原理 圖2-9 介殼蟲的染色體（PCM照片） （6）、偏光顯微鏡 偏光顯微鏡（）用于檢測雙折射物質(zhì)，如纖維、紡錘體、膠原蛋白、染色體等。與普通顯微鏡的區(qū)別在于光源前面有一個(gè)偏光板（偏光鏡），使進(jìn)入顯微鏡的光為偏振光，并且有一個(gè)分析器（帶有偏振光的偏光鏡）方向垂直于偏光鏡）在鏡筒中。 這種顯微鏡的載物臺(tái)可以旋轉(zhuǎn)。 當(dāng)單個(gè)折射物質(zhì)放置在載物臺(tái)上時(shí)，無論載物臺(tái)如何旋轉(zhuǎn)，由于兩個(gè)偏光鏡是垂直的，因此在顯微鏡中看不到光。 當(dāng)引入雙折射材料時(shí)，通過旋轉(zhuǎn)平臺(tái)來檢測物體，因?yàn)楣庠诖┻^材料時(shí)會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn)。
（7）微分干涉相差顯微鏡 1952年，根據(jù)相差顯微鏡的原理發(fā)明了微分干涉相差顯微鏡（PE）。 DIC顯微鏡也稱為相差顯微鏡（示波器）。 其優(yōu)點(diǎn)是可以顯示結(jié)構(gòu)的三維投影圖像。 與相差顯微鏡相比，標(biāo)本可以稍厚一些偏光顯微鏡可以根據(jù)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的不同，折射率差異更大，因此圖像具有更強(qiáng)的三維效果。 DIC顯微鏡的物理原理與相差顯微鏡完全不同，技術(shù)設(shè)計(jì)也復(fù)雜得多。 DIC使用偏振光，有四個(gè)特殊的光學(xué)元件：起偏器（）、DIC棱鏡、DIC滑翔機(jī)和檢偏器（）。 起偏器直接安裝在聚光系統(tǒng)前面，使光線發(fā)生線偏振。 聚光鏡中安裝有石英棱鏡（DIC 棱鏡）。 這種棱鏡可以將一束光分解成兩束偏振方向不同的光（x和y），并且兩者形成一個(gè)小角度。 聚光鏡使兩束光束平行于顯微鏡的光軸。 最初，兩束光具有相同的相位。 在穿過試樣的相鄰區(qū)域后，由于試樣的厚度和折射率不同，兩束光之間會(huì)產(chǎn)生光程差。 第二個(gè)棱鏡，即 DIC 滑翔機(jī)，安裝在物鏡的后焦平面上，它將兩個(gè)光波合二為一。
此時(shí)，兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。 最后，光束穿過第二個(gè)偏振裝置，即檢偏器。 在光束在目鏡中形成 DIC 圖像之前，檢偏器與偏振器成直角。 分析器將兩個(gè)垂直的光波組合成具有相同偏振平面的兩束光束，使它們發(fā)生干涉。 x 波和 y 波之間的光程差決定了傳輸?shù)墓饬俊?當(dāng)光程差為0時(shí)，沒有光通過檢偏器； 當(dāng)光程差等于波長的一半時(shí)，通過的光達(dá)到最大值。 所以在灰色背景下，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明暗差異。 為了達(dá)到圖像的最佳對(duì)比度，可以通過調(diào)節(jié)DIC滑塊的縱向微調(diào)來改變光程差。 光程差可以改變圖像的亮度。 調(diào)整DIC滑塊可以使標(biāo)本的精細(xì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正投影或負(fù)投影圖像，通常是一側(cè)亮，另一側(cè)暗，從而產(chǎn)生標(biāo)本的人造三維感，類似于大理石上的浮雕（圖2 -10）。 DIC顯微鏡使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如細(xì)胞核、線粒體等，具有特別強(qiáng)的三維感，使其適合顯微操作。 目前基因注射、核移植、轉(zhuǎn)基因等顯微操作常在此顯微鏡下進(jìn)行。 圖 2-10 DIC 顯微鏡下的硅藻（偽彩色）（8）。 倒置顯微鏡的組成與普通顯微鏡相同，只是物鏡和照明系統(tǒng)相反。 前者在載物臺(tái)下，后者在載物臺(tái)上方（圖2-11），用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，配有相差物鏡。 圖2-11 徠卡倒置顯微鏡 自20世紀(jì)80年代以來，光學(xué)顯微鏡的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)取得了長足的進(jìn)步。 發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在注重實(shí)用性和多功能性的提高。
裝配設(shè)計(jì)傾向于采用組合方式，將普通光學(xué)顯微鏡加上相襯、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置集成在一起，操作靈活、易于使用。 2. 電子顯微鏡 (1)、透射電子顯微鏡 1. 基本原理 小于 0.2 μm 的精細(xì)結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡下無法清晰可見。 這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu) (ures) 或超顯微結(jié)構(gòu) (;)。 為了清楚地看到這些結(jié)構(gòu)，必須選擇波長較短的光源以提高顯微鏡的分辨率。 1932年，Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（TEM）。 電子束的波長比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射的電子束的電壓的平方根成反比，也就是說，電壓越高，波長越短。 目前TEM的分辨率可以達(dá)到0.2nm。 電子顯微鏡（圖2-12）和光學(xué)顯微鏡的成像原理基本相同。 不同的是前者使用電子束作為光源，電磁場作為透鏡。 另外，由于電子束的穿透力很弱，用于電子顯微鏡的標(biāo)本必須制成厚度約為50 nm的超薄切片。 這種切片需要用超薄切片機(jī)（）來制作。 電子顯微鏡的放大倍數(shù)高達(dá)近百萬倍，由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)五部分組成。
表2-2 不同光源的波長名稱分別稱為可見光、紫外光、、 樣品制備技術(shù) 1) 超薄切片通常用鋨酸和戊二醛固定樣品，包埋在環(huán)氧樹脂中，通過熱力推進(jìn)樣品切片。擴(kuò)張或螺旋推進(jìn)（圖2-13）。 切片厚度20~50nm。 切片用重金屬鹽染色以增加對(duì)比度（圖 2-14）。 圖2-13 徠卡超薄切片機(jī) 圖2-14 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖像（偽彩色） 2）負(fù)染技術(shù) 負(fù)染是利用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸鈾酰）鋪在載體網(wǎng)上進(jìn)行染色樣本; 吸收染料，樣品干燥后，樣品凹下區(qū)域鋪有一層薄薄的重金屬鹽，而凸出區(qū)域沒有染料沉積，產(chǎn)生負(fù)染色效果（圖2-15） ），分辨率高達(dá)約1.5nm。 圖2-15 肌動(dòng)蛋白纖維負(fù)染電鏡照片 3) 冷凍蝕刻 冷凍蝕刻(-)也稱為冷凍斷裂(-)。 將標(biāo)本置于-100℃干冰或-196℃液氮中冷凍。 然后用冷刀突然切斷標(biāo)本。 溫度升高后，冰在真空條件下迅速升華，露出斷面結(jié)構(gòu)，這稱為蝕刻（）。 蝕刻后，在45度角的截面上噴涂一層蒸氣鉑偏光顯微鏡可以根據(jù)細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的不同，然后在90度角的截面上噴涂一層碳，以增強(qiáng)對(duì)比度和強(qiáng)度。
然后用次氯酸鈉溶液消解樣品，剝離碳和鉑膜。 這種薄膜稱為復(fù)合薄膜（）。 涂層顯示了試樣蝕刻表面的形狀，在電子顯微鏡下獲得的圖像代表了試樣中細(xì)胞斷裂表面的結(jié)構(gòu)（圖2-16）。 圖2-16 冷凍蝕刻電子顯微鏡照片（2）、掃描電子顯微鏡 圖2-掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（SEM，圖2-17、18、19）出現(xiàn)于20世紀(jì)60年代，用于觀察表面標(biāo)本結(jié)構(gòu)。 其工作原理是利用極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)二次電子。 二次電子的數(shù)量與電子束的入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。 形成二次電子，由探測器收集信號(hào)并通過閃爍體將其轉(zhuǎn)換為光信號(hào)，然后通過光電倍增管和放大器將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，以控制電子束在熒光屏上的強(qiáng)度并顯示與電子束同步的掃描圖像。 該圖像是三維圖像，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射二次電子，在標(biāo)本固定脫水后，噴涂一層重金屬顆粒。 重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出二次電子信號(hào)。 目前掃描電子顯微鏡的分辨率為6~10nm。 人眼可以分辨熒光屏上相距0.2mm的兩個(gè)光點(diǎn)。 掃描電子顯微鏡的最大有效放大倍數(shù)為0.2mm/10nm=。 圖2-18 光學(xué)顯微鏡、TEM、SEM 成像原理對(duì)比 圖2-19 人體血細(xì)胞SEM 照片 圖片來自III. 掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡（STM）是由等人發(fā)明的。 1981年。它是基于量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)。 設(shè)計(jì)。
當(dāng)原子級(jí)尖端在小于一納米的高度掃描樣品時(shí)，電子云在此重疊并施加電壓（2mV~2V）。 尖端和樣品之間發(fā)生隧道效應(yīng)，電子逸出，形成隧道電流。 電流強(qiáng)度和尖端與樣品之間的距離之間存在函數(shù)關(guān)系。 當(dāng)探頭沿給定高度的材料表面掃描時(shí)，由于樣品表面原子不均勻，探頭與材料表面的距離不斷變化，導(dǎo)致電流不斷變化。 變化發(fā)生了。 可視化電流的這種變化揭示了原子水平上的凹凸不平的模式。 掃描隧道顯微鏡的分辨率非常高，橫向可達(dá)0.1～0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。 其優(yōu)點(diǎn)是可以觀察所有三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)）物質(zhì)，而普通電子顯微鏡只能觀察制備好的固體標(biāo)本。 利用掃描隧道顯微鏡直接觀察DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的原子排列，以及生物膜、細(xì)胞壁等某些生物結(jié)構(gòu)的原子排列。 4.顯微操作技術(shù) 圖2-20 尼康NT-88NE顯微操作器/注射器（圖片來自） 顯微操作技術(shù)（）是指在高倍復(fù)合顯微鏡下使用顯微操作器（，圖2-20）操作細(xì)胞或細(xì)胞的方法早期胚胎。 顯微操作器是一種用于控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。 顯微操作技術(shù)包括核移植、顯微注射、嵌合技術(shù)、胚胎移植和顯微解剖。 核轉(zhuǎn)移技術(shù)已經(jīng)存在了幾十年。 (1962) 成功地在非洲爪蟾中進(jìn)行了核移植。 我國著名學(xué)者佟第舟等人在魚細(xì)胞核移植方面做了大量工作，取得了豐碩成果。
