技術特點：
1.一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于：基于無標記細胞整合毒理學技術，借助穩定抒發gpr88的細胞系-gpr88，依靠于已知的gpr88受體的官能團，構建gpr88受體的細胞篩選模型。
2.按照權力要求1所述的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于：在細胞兼容的具有光學生物傳感器功能的384多孔板中接種-gpr88細胞，接種的細胞密度為1.0~4.5×104個/孔，細胞培養液體積為40μl/孔，接種后細胞培養時間為18~24h。
3.按照權力要求1所述的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于：具體包括以下步驟：
[1]將溶化在hbss緩沖鹽中的gpr88受體興奮劑2-pcca以含量為2.4~加入到接種-gpr88細胞的384多孔板中，測量其dmr特征信號譜；
[2]再向步驟[1]中加入了gpr88受體興奮劑2-pcca的細胞板中繼續加入與具有最高響應硬度對應的最低含量（ec100）的2-pcca，檢查脫敏dmr特征信號譜；
[3]獲得的所有dmr特征信號譜具有含量-響應依賴關系且具有靈敏性、飽和性及特異性的特征。
4.按照權力要求1所述的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于：待測樣品具有興奮活性的篩選步驟如下：
[1]將溶化在hbss緩沖鹽中的gpr88受體興奮劑2-pcca以含量為2.4~加入到接種-gpr88細胞的384多孔板中，測量其dmr特征信號譜；
[2]將待測樣品以0.01nm~100μm加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，測量其dmr訊號譜；
[3]關聯剖析步驟[1]和步驟[2]中的dmr訊號譜，若步驟[2]的dmr訊號譜與[1]中的dmr特點譜具有輪廓相像性；
[4]向步驟[2]中加入了待測樣品的細胞板中繼續加入與步驟[1]中相同含量的2-pcca細胞膜模型制作，檢查dmr訊號譜；若此dmr訊號比步驟[1]中2-pcca的訊號弱；
[5]向步驟[1]加入了gpr88受體興奮劑2-pcca的384多孔板中，繼續加入與步驟[2]中相同含量的待測樣品，檢查其dmr訊號，若此dmr訊號硬度高于步驟[2]中的dmr訊號硬度，則判定此樣品為gpr88受體的興奮劑。
5.按照權力要求1所述的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于：待測樣品具有拮抗活性的篩選步驟如下：
[1]將待測樣品和gpr88受體興奮劑2-pcca分別加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，待測樣品含量為0.01nm~100μm，2-pcca含量為2.4~，檢查dmr訊號譜；
[2]若步驟[1]中待測樣品不造成dmr訊號譜，再向步驟[1]中加入了待測樣品的細胞板中繼續加入與步驟[1]中相同含量的2-pcca，檢查dmr訊號譜；若此dmr訊號比步驟[1]中2-pcca的訊號弱，可判定待測樣品是gpr88受體的拮抗劑。
6.按照權力要求1所述的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于：待測樣品對gpr88通路有調節活性的步驟如下：
[1]將待測樣品和gpr88受體興奮劑2-pcca分別加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，待測樣品含量為0.01nm~100μm，2-pcca含量為2.4~，檢查dmr訊號譜；
[2]再向步驟[1]中加入了待測樣品的細胞板中繼續加入與步驟[1]中相同含量的2-pcca，檢查dmr訊號譜，檢查時間為1~；若此dmr訊號比步驟[1]中2-pcca的訊號在上升期、平臺期和延滯期某一個階段不同；
[3]將gpr88受體興奮劑2-pcca以含量2.4~加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，預處理5~，加入與步驟[1]中相同含量的待測樣品，檢查其dmr訊號，若此dmr訊號譜與步驟[1]中的樣品的dmr訊號譜一致，可判定待測樣品是gpr88受體下游訊號通路的調節劑。
7.按照權力要求6所述的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，其特點在于，所述上升期為1~30min、平臺期為30~60min和延滯期為60~。
技術總結
本發明涉及無標記G蛋白偶聯受體（GPCR）的細胞篩選模型建立方式及應用，具體地說是一種無標記細胞膜受體GPR88的細胞篩選模型。本發明基于無標記細胞整合毒理學技術，借助GPR88穩定抒發的細胞系，構建了篩選GPR88受體興奮劑和拮抗劑的方式。此方式還可用于研究影響受體下游通路的調節劑。本發明建立的GPR88細胞篩選模型不需螢光標記且檢查過程無需額外添加指示劑，具有靶向?通路整合響應、對細胞無損傷、檢測結果可靠、靈敏度高、篩選通量高、周期短及操作簡便等特征。其用于從天然產物庫、代謝產物庫及組合物理庫中找尋GPR88受體的興奮劑、拮抗劑和通路調節劑，及GPR88受體密切相關的中樞神經系統疾患，如精神分裂、帕金森病、焦慮癥、抑郁癥、藥物成癮等精神疾患的抗生素篩選。
技術研制人員：梁鑫淼;侯滔;王紀霞;薛珍珍;單彩龍;王俊
受保護的技術使用者：南京醫藥城國科化物生物醫藥科技有限公司
技術研制日：2019.12.20
技術公布日：2021.06.22
本發明涉及無標記gpcr細胞篩選模型的建立方式，具體地說是一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型及應用。
背景技術：
g蛋白偶聯受體（g--,gpcrs）是七次跨膜受體，其數目高達800個，介導從血糖調節到無數重要的生理和病理過程，因而是小分子抗生素開發中最受關注的抗生素靶向[allen,j.a.,etal.,011,51,117?144.]。目前fda批準的約40％的抗生素靶標為gpcrs，但是這種抗生素靶點的gpcrs只占總gpcrs的20%，還有大量的gpcrs，尤其是孤兒g蛋白偶聯受體（--,）仍然未得到開發和借助[rask-,m.,etal.,,10,579?590；wold,e.a.,etal.,,62(1),88-127；lu,s.etal.,,62(1),24-45；,s.,,1705,1?21；,a.s.,etal.,,16,829?842；chung,s.,etal.,,153(s1),s339；fang,y.,etal.,,6,295；,w.k.,etal.,&,22,362?369.]。
g蛋白偶聯受體-88（gpr88），是gpcrs家族的一員，在紋狀體、尾狀核、伏隔核和嗅囊腫中抒發，其中樞神經系統在紋狀體中的抒發非常強，與多巴胺d2受體的抒發相當[,k.,etal.,,69,314.]。研究表明，gpr88涉及調節各類腦部和行為功能，包括認知，情緒，運動控制和基于獎勵的學習，因而正成為醫治中樞神經系統疾患（包括精神分裂癥、帕金森氏病、焦慮癥、抑郁癥和成癮癥等精神疾患）的新型抗生素靶標，并且目前gpr88的內源性官能團一直未知[,r.,etal.,,30,397?414；jin,c.y.,etal.,,5(7),576-587；jin,c.y.,etal.,,7(10),1418-1432；ye,n.,etal.,,10(1),190-200]。鑒于gpr88對于中樞神經系統疾患的巨大醫治潛力，建立gpr88受體的細胞篩選模型，用以發覺gpr88受體的內源性官能團、高活性興奮劑、拮抗劑及通路調節劑，對闡明gpr88的生物學功能和毒理學特點，以及推動中樞神經系統疾患新型靶標抗生素的發展具有重大意義。
目前受體的驍龍量篩選方式主要有傳統的放射性官能團受體結合實驗法、gtpγs結合實驗法、環乙酸腺苷（camp）剖析法、鈣流檢查法、報告基因檢查法、受體的內吞檢查法及β-的招募檢查法等[,d.b.,etal.,,265,l421-l429；,c.,etal.,,74,489-508；zhang,r.,etal.,,33,372-384；emkey,r.,etal.,in:,w.p.,etal.(eds.),ing:,；fan,f.,etal.,,5,127-136；,f.,etal.,y2010,28,237-245；,l.m.,etal.,2002,115,455-465.]。但這種方式都有一定的局限性，如傳統的放射性官能團受體結合實驗法須要漂洗和過濾，實驗周期長及通量低等不足，此技術也不能分辨受體的興奮劑和拮抗劑；其余的gpcr檢查方式主要針對某條訊號通路的激活，對多條通路的激活難以區別，須要螢光蛋白標記或則額外加入指示劑，操作繁雜，并且指示劑的加入對細胞也會形成一定的損傷，影響篩選結果的可靠性。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，以解決上述背景技術中提出的問題。
為了實現上述目的，利用于新型無標記細胞整合毒理學技術，提供一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，以聯發科量篩選gpr88受體內源性官能團、激動劑、拮抗劑和通路調節劑，及gpr88受體密切相關的中樞神經系統疾患，如精神分裂癥、帕金森氏病、焦慮癥、抑郁癥和成癮癥等精神疾患的抗生素篩選應用。
本發明的技術方案為：
基于無標記細胞整合毒理學技術，借助穩定抒發gpr88的細胞系-gpr88，利用于已知的興奮劑，構建gpr88受體的細胞篩選模型。按照待測樣品的dmr訊號譜與已知興奮劑的dmr特征信號譜的相像性和特異性，判定待測樣品的興奮活性、拮抗活性，或則對下游通路的調節影響。
其中，所述的無標記細胞整合毒理學技術為借助共振波導光柵（rwg）生物傳感將抗生素引起的細胞內成份的動態再分布現象轉化為整體的、動態的波長位移響應訊號，此訊號為波長變化的響應值（pm），通過epic光學生物傳感384多孔板實現。模型的構建過程為：
1)在細胞兼容的具有光學生物傳感器功能的384多孔板中接種-gpr88細胞，接種的細胞密度為1.0~4.5×104個/孔，細胞培養液體積為40μl/孔，接種后細胞培養時間為18~24h。
2)將溶化在hbss緩沖鹽中的gpr88受體興奮劑2-pcca以含量為2.4~加入到接種-gpr88細胞的384多孔板中，測量其dmr特征信號譜；
3)向步驟2)中加了gpr88受體興奮劑2-pcca的-gpr88細胞的384多孔板中繼續加入具有最高響應硬度對應的最低含量（ec100）的2-pcca，測量其特點dmr訊號譜；
4)獲得的所有dmr特征信號譜具有含量-響應依賴關系且具有靈敏性、飽和性及特異性。
其中，所述待測樣品具有興奮活性的篩選步驟如下：
1)將溶化在hbss緩沖鹽中的gpr88受體興奮劑2-pcca以含量為2.4~加入到接種-gpr88細胞的384多孔板中，測量其dmr特征信號譜；
2)將待測樣品以含量為0.01nm~100μm加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，測量其dmr訊號譜；
3)關聯剖析步驟1）和步驟2）中的dmr訊號譜，若步驟2）的dmr訊號譜與1）中的dmr特點譜具有輪廓相像性，則進行下一步驟；
4)向步驟2)中加入了待測樣品的細胞板中繼續加入與步驟1)中相同含量的2-pcca，測量dmr訊號譜；若此dmr訊號比步驟1)中2-pcca的訊號弱。
5)向步驟1)加入gpr88受體興奮劑2-pcca的接種-gpr88細胞的384多孔板中，繼續加入與步驟2)中相同含量的待測樣品，檢查其dmr訊號，若此dmr訊號硬度高于步驟2)中的dmr訊號硬度，則判定此樣品為gpr88受體的興奮劑。
其中，所述待測樣品具有拮抗活性的篩選步驟如下：
1)將待測樣品和2-pcca分別加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，待測樣品含量為0.01nm~100μm，2-pcca含量為2.4~，檢查dmr訊號譜；
2)若步驟1）中待測樣品不造成dmr訊號譜，向步驟1）中加入了待測樣品的細胞板中繼續加入與步驟1）中相同含量的2-pcca，檢查dmr訊號譜；若此dmr訊號比步驟1）中2-pcca的訊號弱，可判定待測樣品是gpr88受體的拮抗劑。
其中，所述待測樣品對gpr88通路有調節活性的步驟如下：
1)將待測樣品和2-pcca分別加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，待測樣品含量為0.01nm~100μm，2-pcca含量為2.4~，檢查dmr訊號譜；
2)再向步驟1）中加入了待測樣品的細胞板中繼續加入與步驟1）中相同含量的2-pcca，檢查dmr訊號譜，檢查時間為1~；若此dmr訊號比步驟1）中2-pcca的訊號在上升期、平臺期和延滯期某一個階段不同；
3)將gpr88受體興奮劑2-pcca以含量2.4~加入到接種-gpr88細胞的多孔板中，預處理1~，加入與步驟1）中相同含量的待測樣品，檢查其dmr訊號，若此dmr訊號譜與步驟1）中的樣品的dmr訊號譜一致，可判定待測樣品是gpr88受體下游訊號通路的調節劑。
其中，所述上升期為1~30min、平臺期為30~60min和延滯期為60~。
筆記本發明構建的一種無標記細胞膜受體gpr88的細胞篩選模型，可為對商品化的小分子庫、自主制備的天然產物提取物、組分或化合物庫及物理修飾物進列寬通量篩選，獲得gpr88受體的興奮劑、拮抗劑和通路調節劑。據悉，按照靶向與癌癥的相關性，發覺gpr88受體在神經系統疾患，如精神分裂癥、帕金森氏病、焦慮癥、抑郁癥和成癮癥等精神疾患中發揮重要作用，也可舉辦相關疾患的抗生素篩選。
附圖說明
圖1（a）不同含量的2-pcca在-gpr88細胞上的dmr特征信號譜；（b）不同含量的2-pcca在-gpr88細胞上的含量-響應依賴曲線。
圖2（a）不同含量的2-pcca預處理-gpr88細胞2h后，固定含量2-pcca的dmr訊號譜；（b）不同含量的2-pcca預處理-gpr88細胞2h后，固定含量2-pcca的dmr訊號譜對應的含量-響應依賴曲線。
具體施行方法
現結合實例，對本發明做進一步說明。實例僅限于說明本發明，而非對本發明的限定。
施行例1：gpr88受體興奮劑2-pcca在-gpr88細胞上的dmr特征信號譜
人胚腎細胞-gpr88細胞來始于中國科大學上海物理化學研究所，倒置顯微鏡購于，2-pcca（款號：hy-）購于公司。細胞培養板為epic光學生物傳感器384多孔板，購于康寧公司，檢查平臺為康寧第三代epic?成像儀，檢查的訊號為細胞動態質量重置（dmr）造成的波長位移。
將處于對數生長期的-gpr88細胞，接種于細胞兼容的384多孔板中，所用培養基為dmem（#.01b,），每孔的接種容積為40μl，每孔接種的細胞數量為3.0×104個，將接種好的細胞板放在細胞培養箱中培養20~24h，至細胞融合度達95%左右，進行活性檢查。將在多孔板中的細胞培養液換成hank's平衡鹽氨水（hbss，含20mm的hepes），每孔加入容積為30μl，加入以后，放置于epic?成像儀上平衡90min；重新掃描2min的基線，將2-pcca加入多孔板中，每孔加入容積為10μl，含量為、、、、、625nm、312.5nm、156nm、78nm、39nm、20nm、10nm、5nm和2.4nm，平行4次，放在epic儀器上實時檢測dmr訊號，基于細胞經2-pcca作用的內dmr最大響應值處估算2-pcca的ec50值，結果見圖1。
實驗結果表明2-pcca激活gpr88受體形成dmr訊號響應，且呈現劑量依賴，劑量響應曲線呈三相“s”型且都達到飽和響應，最高的dmr響應值達300pm，其ec50值為1.52±0.26μm。
施行例2：-gpr88細胞的脫敏dmr特征信號譜
將處于對數生長期的-gpr88細胞，接種于細胞兼容的384多孔板中，所用培養基為dmem（#.01b,），每孔的接種容積為40μl，每孔接種的細胞數量為3.0×104個，將接種好的細胞板放在細胞培養箱中培養20~24h，至細胞融合度達95%左右，進行活性檢查。將在多孔板中的細胞培養液換成hank's平衡鹽氨水（hbss，含20mm的hepes），每孔加入容積為30μl，加入以后，放置于epic?成像儀上平衡90min；將不同含量的2-pcca加入多孔板中預處理-gpr88細胞，每孔加入容積為10μl，含量為、、、、、625nm、312.5nm、156nm、78nm、39nm、20nm、10nm、5nm和2.4nm，平行4次；重新掃描2min的基線，將固定含量的2-pcca加入多孔板中，每孔加入容積為10μl，含量為，平行4次，放在epic儀器上實時檢測dmr訊號，基于細胞經2-pcca作用的內dmr最大響應值處估算ic50值，結果見圖2。
實驗結果表明2-pcca呈劑量依賴地脫敏gpr88受體，劑量響應曲線呈三相“s”型且都達到飽和響應，其的ic50值為2.61±0.44μm。
本發明基于無標記細胞整合毒理學技術，構建了gpr88無標記篩選模型細胞膜模型制作，此模型具有不須要螢光標記且測量過程無需額外添加指示劑的優勢，高效可靠的篩選商品化的小分子庫、自主制備的天然產物提取物、組分或化合物庫及物理修飾物，以獲得gpr88受體的興奮劑、拮抗劑和通路調節劑及gpr88受體密切相關的中樞神經系統疾患，如精神分裂癥、帕金森氏病、焦慮癥和成癮癥等精神疾患的抗生素。
雖然早已示出和描述了本發明的施行例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對那些施行例進行多種變化、修改、替換和變形，本發明的范圍由所附權力要求及其等同物限。