這篇綜述重點(diǎn)說明使用RIPA裂解液提取總蛋白以及下游實(shí)驗(yàn)中可能存在的問題。
RIPA裂解液常用于從腰部植物細(xì)胞和組織中提取總蛋白[1]。并且因?yàn)?a href='http://www.njxqhms.com/gaozhongwuli/zongheyuqita/2962.html' title='量子力學(xué)：從水的外在表現(xiàn)到蛋白質(zhì)的內(nèi)在結(jié)構(gòu)' target='_blank'>蛋白質(zhì)間有較大的差別和非蛋白成分的干擾，所以從一個(gè)樣本中同時(shí)釋放和溶化所有蛋白質(zhì)是十分困難的。非常是一些整合到膜上的蛋白質(zhì)，或與其他蛋白質(zhì)/核苷酸產(chǎn)生復(fù)合物時(shí)，就大大制約了提取效率。
因而可以推論，蛋白質(zhì)在提取過程中或多或少的與在體內(nèi)時(shí)真實(shí)情況不盡相同。
精典RIPA裂解液中富含低含量的十二羰基硝酸鈉（SDS變性劑），脫氧膽酸（干擾蛋白質(zhì)間互相作用）及其他成份。
盡管RIPA裂解液經(jīng)過不斷改良使用，而且RIPA提取蛋白一般會形成兩個(gè)不同的部份：即RIPA可溶性組分和RIPA不可溶性組分。通常來說，只有RIPA可溶性組分被用于下游實(shí)驗(yàn)，而RIPA不可溶性組分被遺棄。這樣提取的蛋白在使用中會存在什么問題呢？
先來看些文獻(xiàn)數(shù)據(jù)：
研究發(fā)覺細(xì)胞膜蛋白，不同的蛋白在RIPA裂解液中溶化性不同，比如F9中的纖維聯(lián)接蛋白不溶于RIPA裂解液[2]。而大鼠小腦樣品中在RIPA可溶性組分和非可溶組分中富含相同量的7[3]（右圖），表明用RIPA裂解液提取這種特定蛋白質(zhì)的效率非常低。
近些年來，越來越多的研究者密切關(guān)注RIPA不可溶性組分中的蛋白質(zhì)組分，以及它們對下游實(shí)驗(yàn)和整體數(shù)據(jù)的影響。Bai和Laiho用RIPA裂解液從Hela細(xì)胞核中提取蛋白，發(fā)覺可溶組分和不可溶組。
分的蛋白質(zhì)圖譜差別很大，表明蛋白質(zhì)的遺失不成反比[4]（右圖）。
等[5]從突變大鼠的乳房上皮細(xì)胞中提取總蛋白，發(fā)覺在RIPA不可溶性組分中，通過WB很容易測量到EGFR,HSP90,c-Src,和，表明這種蛋白在RIPA不可溶性組分中大量存在（右圖）。
Wang等[6]對比SDS加熱法和RIPA裂解液法從斑馬魚胰臟腺癌中提取蛋白，發(fā)覺RIPA裂解液提取這種樣品時(shí)對于大分子量蛋白的提取效率非常低（右圖）。
Li[7]對比了從大鼠肝臟和腎臟中提取總蛋白RIPA可溶性和不可溶組分以及基于離心管柱法商業(yè)試劑盒提取的蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)覺RIPA不可溶性組分蛋白質(zhì)圖譜與可溶組分圖譜相像，而且不完全相同。那些遺失的不可溶性組分覆蓋了整個(gè)蛋白質(zhì)圖譜分子量范圍，不同樣品的不可溶性組分也有細(xì)節(jié)上的差別。
不同樣品的蛋白質(zhì)遺失是不可預(yù)測的。但是，商業(yè)試劑盒提取蛋白不形成不可溶性組分，更快速，可獲得更高產(chǎn)值更完整的蛋白質(zhì)圖譜（右圖）。
Ngoka[8]用質(zhì)譜平行對比了幾組卵巢癌RIPA可溶性組分和不可溶性組分的蛋白質(zhì)圖譜。結(jié)果發(fā)覺，使用含尿素的裂解液提取RIPA不胺類組分中的平均分子量蛋白質(zhì)濃度比可溶組分高60%。換句話說，許多大分子量蛋白質(zhì)被遺失在RIPA不可溶性組分中。
研究還表明，幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和許多細(xì)胞骨架蛋白被發(fā)覺在RIPA不可溶性組分里。這種結(jié)果表明，因?yàn)榈鞍走z失在不可溶性組分中形成了誤差,RIPA提取蛋白的蛋白質(zhì)譜是不完全的。
借助RIPA裂解細(xì)胞后一個(gè)主要用途是進(jìn)行目標(biāo)蛋白的定性和/或定量剖析[9,10,11]。近來一篇綜述報(bào)導(dǎo)了影響定量免疫印跡的關(guān)鍵誘因[12]，在這項(xiàng)研究中，,laminA,KRT5顯示大量遺失在RIPA不可溶性組分中。
最值得注意的是，組蛋白發(fā)覺僅殘存在于RIPA不可溶性組分中。轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和粘附分子β-也出現(xiàn)在不可溶性組分中。研究中的另一個(gè)重要發(fā)覺是樣品制備方式對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有明顯影響。
Janes[12]對比了NP-40，RIPA裂解液和裂解液的作用，用WB檢查切割方式的-8，發(fā)覺使用裂解液的樣品中可以測量到，而使用RIPA裂解液樣品中沒有檢查到，否認(rèn)了RIPA裂解液不適宜用于這類型的剖析。
借助RIPA裂解液提取的蛋白還被發(fā)覺會人為的降低了個(gè)別蛋白激酶的活性。
用RIPA裂解液裂解結(jié)腸炎細(xì)胞比用NP-40裂解后體外蛋白酶活性下降了5-7倍[13]。[14]等人，對比用RIPA和2%SDS提取活化的T淋巴細(xì)胞的活性，發(fā)覺RIPA裂解液通過釋放GraB人工激活-3。這種結(jié)果強(qiáng)烈建議你們在使用RIPA裂解液時(shí)要做好應(yīng)對數(shù)據(jù)剖析的預(yù)案。
如上所述，使用RIPA裂解液提取總蛋白因?yàn)榈鞍椎倪z失會形成好多問題。
就總蛋白而言，提取過程中
(1)遺失的蛋白會導(dǎo)致蛋白圖譜的變化
(2)改變不同種類蛋白的比列
(3)改變個(gè)別蛋白的活性。
下游實(shí)驗(yàn)中可能存在的問題：
（1）使用RIPA裂解液提取蛋白做WB會人為的提高或增加個(gè)別訊號硬度。RIPA裂解液提取蛋白早已被否認(rèn)有10-30%的蛋白會遺失在不可溶性組分中[12]。
（2）假如一個(gè)細(xì)胞/組織樣品中個(gè)別特定的蛋白質(zhì)可以在可溶性組分和不可溶性組分間轉(zhuǎn)變，或則像前面所述受激活狀態(tài)影響[12]的情況下，數(shù)據(jù)的解釋可能成為一個(gè)大問題。
（3）RIPA裂解液提取的蛋白不適宜用于目標(biāo)蛋白的定性和/或定量剖析。
理想的總蛋白提取應(yīng)當(dāng)是哪些樣的呢？
（1）獲取給定樣品中完整的蛋白質(zhì)圖譜，要真實(shí)的反映所有蛋白質(zhì)種類和比列。大多數(shù)研究人員覺得她們采用的總蛋白提取方式早已反映了體內(nèi)目前的情況，而且極少有人真正的通過平行實(shí)驗(yàn)對比不同的提取方式。在許多情況下，很可能真實(shí)的蛋白質(zhì)圖譜和研究者相信的結(jié)果不完全相同。
（2）獲取最大的蛋白質(zhì)溶化度，最少的蛋白質(zhì)損失以及得到完整的蛋白質(zhì)圖譜才是蛋白質(zhì)提取最佳的選擇。
看了前面的種種問題細(xì)胞膜蛋白，這么現(xiàn)在我們是否已有辦法解決RIPA裂解液提取蛋白過程中存在的問題呢？答案是肯定的！您是否構(gòu)想過有三天蛋白質(zhì)提取也可以像核苷酸提取一樣操作簡單快速得率高？是的，公司把它弄成了現(xiàn)實(shí)，來自英國專利技術(shù)離心管柱蛋白提取法，只需您加入裂解液，過柱離心，不形成不可溶性組分，1分鐘輕松解決蛋白提取遺失問題。
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