在之前的推送內(nèi)容中我們介紹了終點(diǎn)法和反應(yīng)曲線，收到不少粉絲私信要求介紹異常反應(yīng)曲線，這部分內(nèi)容后續(xù)會(huì)陸續(xù)推送，敬請(qǐng)期待。
本期我們延續(xù)上期內(nèi)容，介紹利率法（利率法A和二點(diǎn)利率法）
評(píng)分方法：
要理解此方法，需要先了解酶促反應(yīng)的一些特點(diǎn)。反應(yīng)開始時(shí)有一個(gè)延遲期，在此期間酶剛剛接觸到底物，反應(yīng)產(chǎn)物的增加或底物的消耗很少速度與速率，吸光度的變化不明顯。反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后，反應(yīng)進(jìn)入線性期（又稱零級(jí)反應(yīng)期），此時(shí)底物濃度仍處于過剩狀態(tài)，在此階段產(chǎn)物的增加或底物的消耗達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗或產(chǎn)物的生成量不變。此時(shí)的反應(yīng)速率與底物濃度無關(guān)，只與酶活性有關(guān)。通過檢測(cè)此期間產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量來計(jì)算酶活性。隨著時(shí)間的推移，由于酶的催化消耗和產(chǎn)物的增加，底物發(fā)生逆反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可能具有抑制酶反應(yīng)的作用。 酶促反應(yīng)緩慢，反應(yīng)速率減慢，偏離線性反應(yīng)期，進(jìn)入一級(jí)反應(yīng)期，不再是線性的。速率A法是通過測(cè)定零級(jí)反應(yīng)線性期內(nèi)測(cè)光點(diǎn)的吸光度變化來獲得被測(cè)物質(zhì)的濃度或活度值。
評(píng)價(jià)方法示例 1（評(píng)價(jià)方法 A）
例如在ALT項(xiàng)目中，血清中的ALT催化試劑盒中酶的特定底物丙氨酸生成產(chǎn)物丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶（LDH）作用下偶聯(lián)還原性輔酶體系將NADH轉(zhuǎn)化為NAD+。由于NADH在340nm處有吸收峰，在此波長下NADH的還原速度與ALT的活性成正比，因此可得到血清中ALT的活性。
反應(yīng)原理如下：
如下圖所示，日立7180上的反應(yīng)曲線
橫軸代表時(shí)間（以測(cè)光點(diǎn)表示，10分鐘內(nèi)記錄了34個(gè)吸光度），縱軸代表吸光度。反應(yīng)模式為先加入樣本，再加入R1試劑，開始測(cè)光（每隔18秒記錄一次吸光度）。此過程中沒有發(fā)生反應(yīng)。從反應(yīng)曲線可以看出，吸光度值較高，主要是因?yàn)樵噭┲械腘ADH在340nm波長處產(chǎn)生的吸光度。當(dāng)加入R2試劑時(shí)，血清中的ALT開始催化底物啟動(dòng)反應(yīng)，由于NADH的消耗，吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。通過測(cè)量測(cè)光點(diǎn)20-26的吸光度變化（通過最小二乘法計(jì)算吸光度變化，所有測(cè)光點(diǎn)都參與計(jì)算，如下圖紫色區(qū)域所示），變化率與ALT的活性成正比。
采用利率方法A的項(xiàng)目包括
幾乎所有的酶：ALT、AST、GGT、CHE、AMY、LPS、LDH、ALP、CK、CKMB等等。（還有一種酶不是用速率法測(cè)的，SOD，你知道叫什么名字嗎？想想那個(gè)廣告，大寶天天看，有沒有想到是超氧化物歧化酶~~）
非酶項(xiàng)目：HCY、TBA（部分廠家采用二點(diǎn)速率法）、BUN（部分廠家采用二點(diǎn)速率法）等。
利率法 2 (兩點(diǎn)利率法)
某些項(xiàng)目需要用速率法測(cè)定，但由于方法論或技術(shù)上的原因，反應(yīng)速率不可能像速率法A那樣恒定（速率法A要求在測(cè)光點(diǎn)范圍內(nèi)，速度變化恒定，后面會(huì)發(fā)一篇文章介紹具體的判斷規(guī)則）。因此，采用選取的兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)的平均速度進(jìn)行計(jì)算，又稱固定時(shí)間法。這是兩點(diǎn)速率法與速率法A最根本的區(qū)別。
反應(yīng)曲線如下
該結(jié)果是通過計(jì)算27分和20分的平均速度來計(jì)算的。
采用雙點(diǎn)利率法的項(xiàng)目包括
CO2、BUN（某些制造商）、CRE（苦味酸法）、TBA（某些制造商）等。
費(fèi)率法常見問題匯總
為什么有些反應(yīng)是向上的，而有些反應(yīng)是向下的？
如果測(cè)量底物消耗，則反應(yīng)方向向下，如果測(cè)量產(chǎn)物形成，則反應(yīng)方向向上。
二點(diǎn)速率法和速率法A有何區(qū)別？
速度計(jì)算方法不同，速率法A用最小二乘法計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化（實(shí)時(shí)速度），選取測(cè)光點(diǎn)內(nèi)的所有點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，兩點(diǎn)速率法計(jì)算兩測(cè)光點(diǎn)處的平均速度。
哪種方法比較好學(xué)習(xí)？
從嚴(yán)謹(jǐn)角度來說，速率法A更好，但是有些項(xiàng)目，比如CO2，反應(yīng)速率不可能是恒定的，如果選擇使用速率法A，會(huì)出現(xiàn)線性報(bào)警（后面會(huì)介紹）。
為什么設(shè)置第一個(gè)光度測(cè)定點(diǎn)時(shí)，加入R2試劑啟動(dòng)反應(yīng)后并沒有開始測(cè)量速度與速率，但是說明書上卻提示加入R2試劑1分鐘后才開始光度測(cè)定？
由于R2試劑剛剛加入，酶與底物剛剛結(jié)合，處于酶動(dòng)力學(xué)的延遲期，此時(shí)酶活力還未達(dá)到最大，反應(yīng)速率還不是恒定的，因此需要進(jìn)行零級(jí)反應(yīng)測(cè)定。
以上就是方法論的全部內(nèi)容，歡迎大家提出建議。
原文來自 Voice。