1、山東學院實驗報告2014/11/18姓名：XXX系年級：20XX級齊魯醫學班學號：課目:細胞生物學實驗實驗題目:內質網的分離及螢光觀察內質網的分離及螢光觀察【實驗目的】1.學習使用差速離心法獲取內質網2.通過動物細胞內質網的分離，了解細胞器分離的通常原理和技巧。3.觀察內質網的自發螢光和次生螢光，并熟悉螢光顯微鏡的使用技巧。【實驗原理】1.高等動物中內質網象雙凸或平凸透鏡，長徑510um，短徑2-4um，厚2-3um。高等動物的葉肉細胞通常含50-200個內質網，可占細胞質的40%。、葉綠體的數量因物種細胞類型，生態壞境，生理狀態而有所不同。在綠藻中
2、葉綠體形狀多樣，有網狀，帶狀，裂條狀和星形等等，但是容積巨大，可達100um.內質網由內質網外被，類囊體和基質3部份組成。內質網富含3種不同的膜：外膜，內膜，類囊體膜和三種彼此分開的腔：膜間隙，基質和類囊體腔。2.勻漿破碎細胞，借助差速離心方式分離等滲介質中的漂浮顆粒。搜集類內質網大小的顆粒，得到內質網。差速離心法：顆粒在離心場中的沉降速度取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及漂浮介質的黏度有關。在一給定的離心場中，同一時間內，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次降低離心力和離心時間，就才能使非均一漂浮中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管頂部分批搜集即可獲得各類亞細胞組分。葉
3、綠體的分離應在等滲氨水(0.35mol/L硝酸鈉或0.4mol/L蔗糖堿液)中進行，以免滲透壓的改變使內質網遭到損傷。分離過程最好在05的條件下進行：假如在溫度下，要迅速分離和觀察。3.差速離心法特征：介質密度均一；速率由低向高，逐級離心用途：分離大小相差懸殊的細胞核細胞器沉降次序：核內質網，線粒體溶酶體與二溴化物體核糖與高爾碳化物核蛋白體可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯度離心再行分離純化。【實驗材料】1.試劑：0.35mol/L硫酸鈉堿液，0.01吖啶橙。2.用具：粗天平、組織磨碎機、普通離心機、普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡、500ml燒瓶、量筒、滴管、10ml刻度離心管、紗布
4、若干，試管架、無螢光載玻片和蓋玻片。3.材料：新鮮豇豆。【實驗步驟】1.選定新香濃濾萵苣葉，除去葉梗及粗脈，瀝干擦掉生物觀察葉綠體實驗視頻，稱30g于.35mol/LNaCI氨水中；2.將葉和液同放入組織磨碎機中，勻漿3-5min，怠速5000r/min；3.將勻漿液用6層紗布過濾到500ml燒瓶中；4.取上清液4ml在1000r/min下離心2min；5.取下層清液在3000r/min下離心5min（沉淀為內質網和細胞核混和物）；6.將沉淀用2-3ml0.35mol/L硝酸鈉液漂浮；7.取一滴懸液滴片，加蓋片后顯微鏡下觀察。8.另取一滴懸液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙螢光顏料，混勻，蓋上
5、蓋片后，在螢光顯微鏡下觀察。【實驗結果】普通光學顯微鏡下對內質網的觀察圖表1普通光學顯微鏡下萵苣葉的內質網（10*40）普通光學顯微鏡下可看見：番茄內質網呈紅色的橄欖形由于離心不當，帶有一定量的雜質圖表2普通光學顯微鏡下內質網局部放大圖（10*40）仔細觀察可看見基粒深紅色的小顆粒螢光顯微鏡下的內質網圖表3螢光顯微鏡下未被染色的內質網（10*40）螢光顯微鏡下可觀察到：未被染色的內質網自發螢光為火綠色，呈片狀分布，其他部份為白色。圖表4螢光顯微鏡下已被染色的內質網（10*40）吖啶橙染色后螢光顯微鏡下，對內質網的觀察：內質網可發出桔黃色螢光。其中混有的細胞核則發紅色螢光其他大部份，
6、背景為紅色。【實驗結果剖析】1.普通光學顯微鏡下觀察到的內質網呈紅色橄欖形，高倍鏡下仔細觀察可見到內質網內部富含深紅色的小顆粒基粒。另外還可以觀察到形狀較小且不規則的組織碎片，這是由于在離心過程中，由于離心不徹底導致內質網沉降物中富含其他組織碎片。2.螢光顯微鏡下，內質網自發螢光為“火綠色”，次生螢光為“桔黃色”。3.未染色的玻片在螢光顯微鏡下觀察，內質網為“火綠色”，呈片狀分布，且背景為藍色。這是由于內質網自身在懸液中呈片狀分布，而且其中的葉綠素在經過迸發光波照射后，可放出火白色的自發螢光，而且懸液中的其他成分不發生螢光反應4.染色后的玻片在螢光顯微鏡下觀察，內質網為“桔黃色”，其中
7、混有的細胞核碎片中富含的核苷酸在吖啶橙的作用下呈紅色。背景空白處為紅色，這是由于載玻片有雜質。【實驗注意事項】1.螢光顯微鏡有兩套光源系統，先在自然光源下調整好觀察視野，再切換到螢光光源觀察。2.要注意正確的使用螢光顯微鏡：（1）不要直接觀察迸發光源，保護雙眼（2）螢光顏料有一定毒性，要做好防護（3）觀察螢光受多種誘因的影響，如體溫、光、淬滅劑等（4）在螢光觀察時應抓緊時間，立刻照相，避免螢光會發生淬滅，導致整體腫脹。（5）螢光顯微鏡不能隨便開關，汞燈開啟15分鐘之內不能關掉。3.內質網的分離應在等滲堿液（0.35mol/LNaCl）中進行，以免滲透壓的改變使內質網受損傷；4.制做裝片
8、，滴加懸液時，先用吸管吹勻懸液，滴客場，不能滴加太多，若滴加過多的話，則用濾紙片汲取多余液體，否則，觀察目標在鏡頭下懸浮，不便捷觀察。5.吖啶橙可染細胞核，對人體害處比較大，不能用手直接接觸。6.離心管必須等量生物觀察葉綠體實驗視頻，對稱地裝入離心機中；7.分離結束后，先關掉離心機，在離心機徹底停止轉動后，才可打開離心機，取出試樣。8.差速離心法不能得到完全純凈的內質網，要想獲得更純的內質網，可以用密度梯度離心法。9.制片時注意所取的懸液盡量適量，保證視野中的內質網的數目。【實驗反省】1.內質網的稀釋倍數要恰當，數目太少在螢光顯微鏡下無法觀察到。我們組一開始制做的玻片中由于內質網數目太少，在螢光顯微鏡下幾乎觀察不到內質網的存在；2.通過此次試驗，我較為清楚的曉得了螢光的相關概念和螢光顯微鏡的使用方式及相關注意事項，曉得了之后步入實驗室，必須具備優厚的知識和熟練的操作技能，這樣就能將實驗弄成功。