一、簡(jiǎn)介：
1細(xì)胞質(zhì)膜資料
1895年,從研究細(xì)胞透性得出"細(xì)胞膜由連續(xù)的糖類物質(zhì)組成"。
1925年&:用脂單分子膜技術(shù)測(cè)定細(xì)胞膜中脂分子的總面積，提出："細(xì)胞膜是由單層脂分子組成"。
1935年&：從測(cè)定膜的表面張力得出細(xì)胞膜的"三文治結(jié)構(gòu)模型"，即蛋白質(zhì)－脂-蛋白質(zhì)。
1959年:用電鏡觀察生物膜提出"單位膜模型"，將膜的分子結(jié)構(gòu)與超微機(jī)構(gòu)統(tǒng)一上去
長(zhǎng)度：2(暗)3.5(亮)2（暗）=7.5
細(xì)胞質(zhì)膜的主要功能概括如下：
(1)為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境;
(2)選擇性的物質(zhì)運(yùn)輸，包括代謝底物的輸入與代謝產(chǎn)物的排除，其中伴隨著能量的傳遞；
(3)提供細(xì)胞辨識(shí)位點(diǎn)，并完成細(xì)胞內(nèi)外信息跨膜傳遞；
(4)為多種酶提供結(jié)合位點(diǎn)，使酶促反應(yīng)高效而有序地進(jìn)行；
(5)介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的聯(lián)接;
質(zhì)膜參與產(chǎn)生具有不同功能的細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)。
2膜蛋白
雖植物細(xì)胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類繁雜，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)量較少，但卻賦于細(xì)胞膜十分重要的生物學(xué)功能。
按照膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合形式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。
(1)外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因而只要改變堿液的離子硬度甚至提升體溫就可以從膜上分離出來(lái)，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。
(2)內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合十分緊密，通常講只有用去垢劑()使膜解后才可分離下來(lái)。
獲得大量有生物學(xué)活性的質(zhì)膜蛋白對(duì)我們變得十分的重要。
附注：使用分級(jí)抽提方式獲得的“膜蛋白”中只有極少一部份是具備多跨膜區(qū)的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前為止，一直是蛋白組學(xué)的一個(gè)困局，不管采用２－Ｄ技術(shù)也好，ＩＣＡＴ乃至都還不能有效解決這一問(wèn)題。
二、蛋白抽提
談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法……有時(shí)這種方式往往組合到一起對(duì)特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)種類繁雜，不同的蛋白質(zhì)因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)和組成的差別，其溶化度也各不相同.按照蛋白質(zhì)的溶化特點(diǎn)，同時(shí)可選擇不同的溶劑提取，分為水堿液提取和有機(jī)溶劑提取.
然而針對(duì)膜蛋白的提取與細(xì)胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方式就是用不同的離心速率除去胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放下來(lái)。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣ǔ３Ｓ玫挠心懡j(luò)合物，CHAPS(一種離子去污劑），和等表面活性劑。
1、分離膜蛋白的方式（原則性）：
1）先分離膜，之后提取；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法促使細(xì)胞破碎，之后通過(guò)出家離心得到富含膜蛋白的粗組分。（比如：液氮碾磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。差速離心。蔗糖密度梯度離心。搜集37%與41%間的成份，即為質(zhì)膜部份。裂解即可搜集膜蛋白）
2）用特殊的去污劑選擇性的分離。從膜上提取蛋白有許多困難.在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶化出來(lái)，之后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定.去垢劑的選擇一般是根據(jù)他對(duì)所須要蛋白質(zhì)的提取效率來(lái)確定，但在個(gè)別情況下，還要考慮到之后的純化步驟.其實(shí)許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進(jìn)行純化，但最終仍可能須要去除去垢劑.
這往往會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，但若果蛋白質(zhì)是用于測(cè)序的，他將不是一個(gè)問(wèn)題.倘若不是用于測(cè)序的，可考慮使用才能粘附去垢劑的疏水珠.許多文獻(xiàn)和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中，都介紹有許多種不同的可拿來(lái)溶化膜蛋白的去垢劑.但是，她們并不是普遍適用的.在設(shè)計(jì)膜蛋白溶化方案時(shí)，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì).如X-100在280nm處有吸收，假若某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)防止使用這類去垢劑.
將膜劑型與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后，再進(jìn)一步從細(xì)胞膜劑型上將所需的膜蛋白增溶出來(lái).這些做法的用處是可以用強(qiáng)烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白，而無(wú)需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成份或染色質(zhì)成份的混進(jìn).使用這些方式所獲得的膜蛋白，無(wú)論在種類上還是數(shù)目上，都比酸溶化法所得到的蛋白（
通常提取的膜蛋白量常常只占膜蛋白總數(shù)的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無(wú)疑對(duì)于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是十分重要的.第二種方式簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)富含其他蛋白。通常的都是借助4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于水堿液，在氣溫超過(guò)20度時(shí)，此堿液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。借助此性質(zhì)可提取膜蛋白。
3)膜蛋白色譜(of,CMP)CMP分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混和物的層析系統(tǒng)，通常有去垢劑（如SDS）溶化膜蛋白后產(chǎn)生SDS-融膜蛋白，并由甲基磷灰石為固定相的木柱分離純化。甲基磷灰石柱具有陰離子乙酸官能團(tuán)（P-端），又具有陽(yáng)離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。借助原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)覺(jué)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷多肽與固定相中帶電離子間的交換，進(jìn)而達(dá)到分級(jí)分離的目的。
4)次序抽提法：按照細(xì)胞蛋白溶化性的差別，器具有不同溶化能力的蛋白溶化液進(jìn)行抽提的方式。用Tris堿堿液裂解細(xì)胞提取高溶化性蛋白；把未溶化的用標(biāo)準(zhǔn)液溶化提取高疏水性蛋白；最后用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶化液，最后可以再度抽提前兩次抽提后不能溶化的膜蛋白。
5)
原理：高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶漲斷裂后，超高速離心
評(píng)價(jià)：雖然分級(jí)(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,并且可溶性蛋白組分和膜蛋白組分之間依然有不少重復(fù)的點(diǎn).該方式相較MP院士在1998年上發(fā)表的分級(jí)抽提法除以了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡(jiǎn)化,總而言之是一種不錯(cuò)的方式。（）
6)-based：提取時(shí)先裂解液裂胞膜（選用不同的去污試劑是關(guān)鍵），梯度離心分離細(xì)胞器(ER)，之后分級(jí)抽提方式。諸如，除去細(xì)胞器以后的就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時(shí)不溶的部份。
總的體會(huì)：細(xì)胞的量要很充足。以后的定性鑒別常用的技巧有單向免疫擴(kuò)散、免疫電泳及聚丙稀丙酯凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒別膜蛋白，便捷迅速。
到目前為止，提取膜蛋白一直是蛋白學(xué)的一個(gè)困局。
2、分離膜蛋白的方式（操作）
1）分離細(xì)胞膜蛋白的方式：
1、冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于溫度與液氮罐中反復(fù)凍融2次。
2、5000轉(zhuǎn)4度離心，清除核及未裂解的細(xì)胞。
3、取上清12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。
4、12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測(cè)蛋白含量,SDS-PAGE電泳，分裝后-20度保存?zhèn)溆谩?span style="display:none">hd9物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))
A:,,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/ml,20uMpmsf(PH=7.4)
B:,,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/ml,20uMpmsf(PH=7.4)1mMEGTA
C:0.5ug/ml,20uMpmsf,-cl(PH=7.0),
2）分離細(xì)胞膜蛋白的方式：
1、細(xì)胞置于冰上，除去上清，用pH7。4的冷乙酸鹽緩沖液漂洗雙層細(xì)胞兩次
2、加入1ml2%堿液冰浴15min
3、刮下單層細(xì)胞，4度下10000g5min離心
4、溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，之后37度下2000g離心5min
5、收集水相留作剖析
6、用500ul冰涼的C溶化去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再度離心
7、按步驟8再度抽提去污劑相，用C將漂洗后的去污劑相稀釋到初始容積
8、用等量的A分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)
試劑：
1、2%:2%、/LTrisHCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2、緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA）
3、C
/LTrisHCl(pH7.5)
/LNaCl
5mmol/LEDTA(PH7.5)
3）分離細(xì)胞膜蛋白的方式：
7Murea
2M
4%chaps
2.5%sb3-10
個(gè)細(xì)胞，可用此1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速高溫離心30min。
取上清-20保存。
4）分離組織膜蛋白的方式：
1、取組織，加入10mlA于冰上充分勻漿。
2、J6-HC離心機(jī)，4℃離心10min后，所得堿液轉(zhuǎn)到超速離心管。
3、，4℃離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的B重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管，臺(tái)式離心機(jī)，4℃離心30min。
4、收集所得堿液即為膜組份。
A：0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/ml,1ug/mlA,1ug/ml。冰上預(yù)冷。
B：20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%X-100,1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/ml,1ug/mlA,1ug/ml。冰上預(yù)冷。
5）分離組織膜蛋白的方式：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧膽酸鈉
0.1%SDS
以下用時(shí)加入
10mg/mlPMSF異戊烷（終含量10ul/ml）
（30ul/ml）
（10ul/ml）
冰凍組織100mg/細(xì)胞個(gè)，可用RIPA1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速離心30min，20000轉(zhuǎn)高溫離心最佳。
取上清-20保存。
6）分離真菌膜蛋白的方式：
1、于20ml營(yíng)養(yǎng)魚(yú)湯中過(guò)夜培養(yǎng)真菌，37℃，。
2、、20min、4℃離心，去上清。
3、20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心細(xì)胞膜色譜，再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液。
④超聲波破碎真菌。
⑤3000g，10min、室溫下離心除去未破碎真菌。當(dāng)心汲取上清（富含胞質(zhì)成份和真菌外被成份）。
⑥超速離心I：100,000g，60min，4℃，除去上清（胞質(zhì)成份），搜集病菌外被成份。
⑦用10ml含2％的SLS的Tris-Mg緩沖液重懸沉淀物，溫度溫育20-30min。
⑧超速離心II：70,000g，60min，溫度沉淀搜集外膜蛋白，除去上清（含細(xì)胞質(zhì)膜）。重復(fù)⑦、⑧兩步。
⑨充分吸除上清，并按照沉淀容積大小用0.1-0.2ml的ddH2O重懸沉淀物。依據(jù)公式：蛋白含量(mg/ml)=1.450D280-0.740D260測(cè)定外膜蛋白含量，調(diào)節(jié)蛋白含量至40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品-70℃貯存。
試劑
①Tris-Mg緩沖液
10mMTris-Cl
5mMMgCl2
pH7.3，4℃保存
②2%(w/v)十二羰基肌氨酸鈉(SLS)
7）來(lái)始于(1974)
1、取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細(xì)胞膜保持完整。因?yàn)樗c膜的疏水部份之間有反應(yīng)，因而要精確把握分離介質(zhì)中的離心硬度和滲透壓，以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。
2、用-勻漿器，桿與壁間間隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4～6次，每次5S。
3、過(guò)濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部份加入50μl介質(zhì)，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部份再加入先前勻漿的堿液。
4、合并3次堿液細(xì)胞膜色譜，2kg離心10min，棄上清，沉淀部份溶于100μl介質(zhì)，離心10min，棄上清，留沉淀。
5、將沉淀部份加入70%蔗糖15份，之后分別放在三個(gè)離心管中，前面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖堿液各2、2、5、5、3份。
6、700kg離心90min，分離介質(zhì)在1.16～1.18之間產(chǎn)生介面。
7、收集d為1.16～1.18g/ml之間的細(xì)胞膜，加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min，漂洗2次。
8、保存于2.7mmol/LTris-HClpH7.5緩沖液中，用于細(xì)胞膜的研究剖析
8）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方式：（所有操作都在4攝氏度下進(jìn)行）
1.在冰涼的勻漿緩沖液中搗碎組織塊，倒流血水。用勻漿緩沖液洗滌組織尸塊，并將它們放在冰上，重復(fù)上述操作，直到組織碎成1mm3大小的碎片，且無(wú)可見(jiàn)的血。
2.加入5倍（容積比）與組織塊容積的緩沖液，再放在冰浴的氏玻璃勻漿器中，抽研10-20次，勻漿組織。
3.勻漿4攝氏度600g離心10min，上清含細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞溶膠。沉淀中有未破碎的細(xì)胞及細(xì)胞核。棄沉淀。
4.上清4攝氏度8000g離心10min，沉淀線粒體。棄沉淀。
5.上清4攝氏度離心20min，棄上清。
6.用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續(xù)勻漿，再度4攝氏度，離心20min，棄上清。
7.用小容積的適合緩沖液重新徹底勻漿沉淀。
8.粗制的樣品可于干冰/乙酸中速凍，保存于-80攝氏度。
9）用特殊的去污劑選擇性的分離。
簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)富含其他蛋白。
原理：4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于水堿液，但在37度時(shí)，此堿液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。
方案
1、放射性標(biāo)記受試細(xì)胞
2、將標(biāo)記的細(xì)胞置于冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷乙酸鹽緩沖液漂洗雙層細(xì)胞兩次
4、加入1ml2%堿液冰浴15min
5、刮下單層細(xì)胞，4度下10000g5min離心
6、溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，之后37度下2000g離心5min
7、收集水相留作剖析
8、用500ul冰涼的C溶化去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再度離心
9、按步驟8再度抽提去污劑相，用C將漂洗后的去污劑相稀釋到初始容積
10、用等量的A分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)
試劑：
1）2%:2%、/LTrisHCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2）緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA）
3）C
/LTrisHCl(pH7.5)
/LNaCl
5mmol/LEDTA(PH7.5)
10）動(dòng)物中：高度純化的質(zhì)膜是質(zhì)膜蛋白研究的基礎(chǔ)，制備純化方式也好多，動(dòng)物材料中以
1、蔗糖密度梯度離心、
2、水溶性雙水相法、
3、自由流電泳等方式為主。
