作者單位：浙江醫科學院附屬三院廣東省婦嬰保健院骨科病變實驗室
DOI：/10.1186/-021-02211-2
明天小編給你們帶來一篇2022年1月of&刊物的文章：LipidbytheTFEB-ERRαaxistoEC（IF=12.658）。據報導，雌激素相關受體α(ERRα)在卵巢內膜癌(EC)的進展中起關鍵作用。但是，ERRα介導的脂類重組在EC中的潛在機制尚不清楚。本研究闡述了轉錄因子EB(TFEB)-ERRα誘導脂類重組推動EC的進展。
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研究背景
高體重指數(BMI)影響病人當前和未來的健康，被覺得是全球男性死亡的五大緣由之一。在所有男性惡性病變中，卵巢內膜癌(EC)與肥胖的相關性最強，肥胖被覺得是更年期后婦女發生EC的一個特別重要的危險誘因。考慮到EC病人伴有超重和糖尿病的病狀，病變脂類代謝仍然是研究的重點。但是，脂類代謝在EC中的作用機制尚不清楚。
雌激素相關受體α(-α，ERRα，NR3B1,ESRRA)屬于核受體超家族，是一種具有組成性活性的非官能團孤兒核受體。作為一種轉錄因子，ERRα與其公認的共激活因子二溴化物酶體增殖激活受體(PPAR)共激活因子-1α(PGC-1α)結合，在調節細胞氧化乙酸化和脂類體代謝中發揮核心作用細胞膜流動性，進而形成許多生物學功能。
轉錄因子EB(EB,TFEB)是溶酶體生物發生和凋亡的主要調節因子，在不同癌癥中具有重要的致病作用，TFEB通過PGC-1α和PPARα對脂類分解代謝進行全局轉錄控制。ERRα和TFEB在脂類代謝中的作用及其影響惡性細胞轉移和侵襲的機制還有待進一步研究。該研究推斷TFEB-ERRα訊號通過調節脂類代謝，廣泛影響細胞膜功能，促使EC的侵襲和轉移。
研究材料與技巧
借助腫瘤基因組圖譜(TCGA)的RNA測序數據對TFEB和ERRα進行剖析和驗證。采用雙螢光素酶報告基因和染色質免疫沉淀定量聚合酶鏈反應(ChIP-qPCR)評估TFEB-ERRα軸。通過體外功能失去和功能獲得實驗來研究其機制。脂類組學和蛋白質組學測量TFEB-ERRα相關脂類代謝途徑。掃描電鏡觀察假足。據悉，通過免疫組織物理和脂類組學對臨床組織樣本進行驗證ERRα相關脂類。
結果
1、TFEB和ERRα在EC病人中高抒發，并與EC進展相關。
研究在TCGARNA-seq數據庫中的543例EC樣本和23例正常樣本中研究了這兩個基因的抒發和臨床病理數據。TFEB高抒發與癌癥進展程度明顯相關(p0.05;圖1B)。據悉，TFEB高抒發的EC病人的總生存期(OS)高于低抒發的EC病人(p系數=0.168;p<0.001;圖1G)。
圖1生物信息學剖析顯示TFEB推動ERRα轉錄參與EC進展結果
2、ERRα是TFEB介導EC脂類代謝的直接靶向。
螢光素酶活性測量顯示，TFEB的推動明顯提高了ERRα抒發引起的相對螢光素酶活性(圖1H)。為了進一步研究TFEB與ERRα之間的串導，研究進行了ChIP-qPCR，結果否認TFEB可以直接結合ERRαDNA的啟動子(圖1I)。其中，器件序列為3’--5’的P5位點最有可能與TFEB結合(圖1J)。那些數據提示TFEB可以直接結合ERRα啟動子并正向調節ERRα抒發。
ERRα是參與脂類分解代謝的關鍵調節因子。對高、低ERRα抒發組進行基因集富集剖析(GSEA)，闡述和鑒別ERRα在EC中的潛在功能。p<0.05，FDR<0.25被覺得明顯富集脂肪酸(FA)代謝和脂肪生成(圖1K)。該研究發覺FA代謝和脂肪生成途徑都與癌癥侵襲幾乎明顯相關(圖1L)，這表明脂類代謝可能在EC的侵襲中起重要作用。
3、TFEB-ERRα主要影響富含甘油磷脂(GPs)的不飽和脂肪酸(UFA)
基于LC-MS/MS系統，篩選和鑒別了7類脂類，由1120種甘油磷脂(GPs)，345種鞘脂(SPs)，285種甘油脂(GLs)和其他脂質組成(圖2A)。最后，測試了36類脂類，其中包括395種磷脂酰膽堿(PCs)，252種三甲基甘油(TAGs)，236磷脂酰乙酸胺(PEs)和其他脂類物種(圖2B)。之后通過正交偏最小二乘判定剖析(OPLS-DA)評估脂類組學變化。人卵巢內膜癌細胞KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)存在顯著的異質性，(圖2C-D)。溶血磷脂酰乙酸胺(LPE)、二甘油酯(DG)、輔酶(Co)和蠟外物(WE)在KLE(TFEB–OV)中明顯減少。KLE(ERRα–OV)病人雙半乳糖二甲基甘油(DGDG)下降細胞膜流動性，神經節苷脂2(GM2)明顯減少。雖然PC和鞘磷脂(SM)隨TFEB或ERRα下降而變化不顯著，但用于評估細胞膜流動性的KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)中PC/SM的比值均顯著下降(p<0.05，圖2E-F)。
作為TFEB的直接靶向，ERRα可明顯下降7種脂類，包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰甘油(PGs)、心磷脂(CLs)、PE(18:1/20:5)、磷脂酰谷氨酸(PS)和神經丙酯(Cers)。KLE(ERRα–OV)中還測量到富含UFA的PC、PG、PS、SMs、CLs和PE(18:1/20:5)降低，飽和脂肪酸(SFA)富含的PC、PG和SM(40:0)降低(圖2G)。據悉，KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)的重疊脂類分別為PC(35:1)+H、PC(36:3)+H和PG(18:1/22:6)+H。
結果表明，ERRα的加入降低了KLE的膜流動性。為此，TFEB驅動ERRα提升GPs中脂肪硝基部份的不飽和度，進而提高膜流動性，促使侵襲和轉移。
圖2ERRα下降EC中含不飽和脂肪酸(UFA)的甘油磷脂(GPs)
4、與ERRα相關的蛋白/脂類在EC的線粒體功能中富集
與對照組相比，用拮抗劑處理的KLE細胞獲得了173個與ERRα相關的蛋白。這種蛋白的生物學過程主要富集于線粒體功能，細胞成份富集于錐體球狀足生長(圖3A)。結合蛋白質組學和脂類組學剖析發覺，含UFA的PC、PG、SMs與含SFA的PC、PG、SMs之間有32個蛋白存在明顯差別(圖3B-C)。剖析主要富集了線粒體功能(圖3D)。
圖3與ERRα相關的蛋白/脂類在EC的線粒體功能中富集
通常來說，在KLE和ECC-1細胞中，所有基因都隨著TFEB-ERRα的下降而下調，隨著TFEB-ERRα的增加而上調(圖4A)。隨即，通過能量剖析儀評估線粒體應激。與對照組相比，0.5μMFCCP處理的KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)細胞的最大耗氧率(OCR)下降，KLE(TFEB–KD)和KLE(ERRα–KD)細胞的最大耗氧率(OCR)增加(p<0.05)。KLE(TFEB?OV)和KLE(ERRα?OV)細胞的基礎呼吸量、最大呼吸量和備用呼吸量等OCR相關指標均明顯下降(p<0.05)。同時，KLE(TFEB?KD)和KLE(ERRα?KD)細胞的基礎呼吸量、最大呼吸量和備用呼吸量均增長(p<0.05)。ATP水平與TFEB、ERRα呈明顯正相關(p<0.05)。在ECC-1細胞中也觀察到類似的趨勢。為了進一步否認TFEB對ERRα介導的線粒體應激的影響，處理后，KLE(TFEB?OV)細胞和ECC-1(TFEB?OV)細胞中的ERRα水平被抑制。KLE(TFEB?OV+)細胞和ECC-1(TFEB?OV+)細胞的OCR無明顯下降(p>0.05;圖4B)。
圖4與ERRα相關的蛋白/脂類在EC的線粒體功能中富集
膜磷脂的脂肪硝基部份的飽和程度決定了細胞膜的生物化學性質，如流動性。和是調節細胞膜中脂肪硝基部份飽和程度的關鍵磷脂重構酶。因而，該研究測試了FA去飽和酶蛋白和。與對照組相比，KLE(ERRα?OV)中/3下降。
與對照組相比，和在KLE(ERRα?KD)中的抒發均增加(p<0.05)。同樣，測量ERRα后，MMP2和皮層肌動蛋白()也會發生改變(p<0.05;圖4C)。
在ECC-1細胞中，/3、MMP2和皮層肌動蛋白的抒發也有類似的變化趨勢。據悉，用處理KLE和ECC-1后，/3、MMP2和皮層肌動蛋白均顯著遭到抑制。但是，當TFEB過抒發時，不能逆轉這種蛋白(p<0.05;圖4D).為了觀察假足的形成，研究發覺KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)細胞的絲足比KLE細胞多，而經SCE處理后的KLE(ERRα–KD)和KLE細胞掃描到的細絲足較少。據悉，TFEB過抒發可去除的抑制作用，使球狀足和偽足得以保留。與KLE細胞偽足一致，TFEB-ERRα推動絲足，醫治的結果可能因TFEB下調而撤消。(圖4E)這種數據表明，TFEB可以通過下調KLE和ECC-1細胞中的ERRα，誘導線粒體應激和磷脂重構，因而提升細胞膜的流動性。
5、TFEB通過EMT訊號通過ERRα推動EC遷移
盡管ERRα在推動EC侵襲轉移中的作用已被否認，但其潛在機制尚不清楚。通過慢病毒介導的策略調節TFEB或ERRα的抒發后，KLE和ECC-1細胞的遷移能力發生了明顯變化。與對照組相比，24h時KLE(TFEB–OV)、KLE(ERRα–OV)和ECC-1(TFEB–OV)的凹痕空間分別高達47.2%、21.9%和126.4%(p<0.05;圖5A-B)。24h時ECC-1(ERRα–OV)的凹痕空間也略有降低，但與對照組比較差別無統計學意義(p>0.05)。與對照組相比，KLE(TFEB–KD)和KLE(ERRα–KD)細胞的損傷間隙在24h時降低了近2倍(p<0.001)。在ECC-1(TFEB–KD)和ECC-1(ERRα–KD)中觀察到類似的趨勢。為了進一步否認TFEB對ERRα介導的細胞遷移的影響，處理后，KLE(TFEB–OV)細胞和ECC1(TFEB–OV)細胞的ERRα水平被抑制。KLE(TFEB?OV+)細胞和ECC-1(TFEB?OV+)細胞的凹痕空間在0~24h無明顯降低。
圖5TFEB通過EMT訊號通過ERRα推動EC遷移
同時，經處理后，KLE(TFEB–OV)和ECC-1(TFEB–OV)細胞提高的遷移能力部份破損(p<0.05;圖5A-B)。RT-qPCR結果顯示，上調TFEB可減少ECC-1和KLE細胞中ERRα和波形蛋白()的抒發，降低上皮細胞鈣粘蛋白(E-)的抒發。相反，TFEB過抒發可提升ERRα和的抒發，增加E-的抒發(p<0.05，圖5C-D)。重要的是，10μM處理KLE(TFEB–OV)和ECC-1(TFEB–OV)細胞時，ERRα、和E-的抒發沒有明顯變化(p>0.05，圖5F)，這表明TFEB可以通過EMT訊號通路以ERRα依賴的形式調節細胞遷移。
6、TFEB-ERRα的高抒發與EC病人血壓異常和轉移有關
為了驗證上述結果，在EC組織微陣列(TMA)上進行了免疫組化，其中包括79個EC標本和32個正常卵巢內膜標本。
癌細胞和正常卵巢內膜腺細胞核中均測量到TFEB陰性免疫反應。EC組織的免疫反應性顯著低于正常卵巢內膜組織(p<0.001;圖6A)。同樣，在79個EC組織樣本中也測量到ERRα，其免疫反應性低于在32個正常卵巢內膜組織中測量到的ERRα(p<0.001;圖6A)。不同國際婦產科聯合會(FIGO)分期、組織學癌癥分級、病理分型、淋巴結轉移(LNM)情況下EC病人TFEB和ERRα抒發差別無統計學意義(p>0.05;圖6C)。但是，EC病人TFEB和ERRα抒發在≤1/2和>1/2肌層浸潤(MI)組之間存在明顯差別(p<0.05;圖6C)。據悉，TFEB與ERRα免疫反應性呈正相關。
有趣的是，在同一人群的血壓研究中，EC病人的血漿總膽固醇(TG)水平明顯低于健康人群，萊州度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白a(APO-A)水平明顯高于健康人群。據悉，卵巢內膜樣子宮內膜癌(EEC)病人的低密度脂蛋白(LDL)水平顯著低于非卵巢內膜樣子宮內膜癌(NEEC)病人。重要的是，LNM病人的HDL和APO-A水平均明顯減少。接出來，該研究比較了不同TFEB/ERRα抒發水平人群的血壓差別。TFEB和ERRα高抒發組(++/+++)血漿HDL和APO-A水平顯著高于TFEB和ERRα低抒發組(-/+)(p<0.05;圖6D)。
綜上所述，TFEB-ERRα下降參與了EC的侵襲和轉移，并與血漿HDL和APO-A水平的增加有關。
圖6幾種蛋白的免疫組織物理抒發及其相關性顯示
7、ERRα誘導的含UFA的GPs的積累是EC進展所必需的
從32例EC組織和19例正常卵巢內膜組織(3例不合格)中獲得的脂類種類，包括359個PCs,324個TAGs,269個PEs和其他脂類種類(圖7A-B)。Venn顯示，三組病人中均監測到PG(18:1/22:6)+H、PC(36:3)+H兩種脂類，KLE(ERRα–OV)和臨床組織中均測量到19種脂類(圖7C)。通過OPLS-DA評估EC病人與正常對照組之間的系統性脂類組學變化。人群之間存在顯著的異質性(圖7D)。據悉，EC組織中磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰谷氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙酸胺(LPE)和PG，鞘脂(SLs)(、、Cer和乙酸神經丙酯(CerP))以及單甘油酯(MG)和TG等GLs均下降。盡管SM下降不顯著，但EC組織中用于評價細胞膜流動性的PC/SM明顯下降(p<0.05，圖7F)。據悉，EC組織中富含UFA的GP，如PC(18:1/18:2)+HCOO、PC(32:2)+H、PG(18:1/22:6)+H和SM(42:1)+HCOO與正常卵巢內膜相比顯著下降(FC>1.5,VIP>1,p<0.05);圖7F)。但與非LNM病人相比，LNM病人的PC(18:1/18:2)+HCOO顯著低于非LNM病人(p<0.05;圖7G)。單誘因二元回歸剖析發覺，PC(18:1/18:2)+HCOO是晚期EC病人的獨立危險誘因(p<0.05，圖7H)。
據悉，研究比較了不同PC(18:1/18:2)+HCOO抒發水平人群的血壓差別。結果表明,血漿萊州度脂蛋白水平低得多的高抒發病人PC(18:1/18:2)+HCOO比PC(18:1/18:2)+HCOO較低(p<0.05)。這種結果表明,ERRα誘導的PC(18:1/18:2)+HCOO降低是一種新的EC進展生物標志物,這可能與血漿萊州度脂蛋白的增加有關。
綜上所述，TFEB-ERRα軸推動含UFA的GP積累，誘導以線粒體應激為特點的脂類重組，因而促使EC的侵襲和轉移。重要的是，含UFA的PC、SM和PG是EC細胞和組織中明顯改變的脂類，其中，TFEB-ERRα軸誘導的PG(18:1/22:6)+H參與了癌癥發生，PC(18:1/18:2)+HCOO是介導EC轉移的ERRα依賴性脂類。
圖7ERRα誘導富含ufa的GPs的積累是EC進展所必需的
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點評
該研究發覺TFEB-ERRα訊號通路通過EMT通路和細胞膜流動性調控卵巢內膜癌細胞的侵襲轉移。這一調控依賴于ERRα參與脂類代謝和細胞膜構建。TFEB-ERRα降低了UFA-PCs,PG(18:1/22:6)+H和PC/SM比值，因而提高了細胞膜流動性促使EC侵襲轉移。
END
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