作者單位：浙江醫(yī)科學(xué)院附屬三院廣東省婦嬰保健院骨科病變實(shí)驗(yàn)室
DOI：/10.1186/-021-02211-2
明天小編給你們帶來(lái)一篇2022年1月of&刊物的文章：LipidbytheTFEB-ERRαaxistoEC（IF=12.658）。據(jù)報(bào)導(dǎo)，雌激素相關(guān)受體α(ERRα)在卵巢內(nèi)膜癌(EC)的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。但是，ERRα介導(dǎo)的脂類(lèi)重組在EC中的潛在機(jī)制尚不清楚。本研究闡述了轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)-ERRα誘導(dǎo)脂類(lèi)重組推動(dòng)EC的進(jìn)展。
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研究背景
高體重指數(shù)(BMI)影響病人當(dāng)前和未來(lái)的健康，被覺(jué)得是全球男性死亡的五大緣由之一。在所有男性惡性病變中，卵巢內(nèi)膜癌(EC)與肥胖的相關(guān)性最強(qiáng)，肥胖被覺(jué)得是更年期后婦女發(fā)生EC的一個(gè)特別重要的危險(xiǎn)誘因。考慮到EC病人伴有超重和糖尿病的病狀，病變脂類(lèi)代謝仍然是研究的重點(diǎn)。但是，脂類(lèi)代謝在EC中的作用機(jī)制尚不清楚。
雌激素相關(guān)受體α(-α，ERRα，NR3B1,ESRRA)屬于核受體超家族，是一種具有組成性活性的非官能團(tuán)孤兒核受體。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，ERRα與其公認(rèn)的共激活因子二溴化物酶體增殖激活受體(PPAR)共激活因子-1α(PGC-1α)結(jié)合，在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化乙酸化和脂類(lèi)體代謝中發(fā)揮核心作用細(xì)胞膜流動(dòng)性，進(jìn)而形成許多生物學(xué)功能。
轉(zhuǎn)錄因子EB(EB,TFEB)是溶酶體生物發(fā)生和凋亡的主要調(diào)節(jié)因子，在不同癌癥中具有重要的致病作用，TFEB通過(guò)PGC-1α和PPARα對(duì)脂類(lèi)分解代謝進(jìn)行全局轉(zhuǎn)錄控制。ERRα和TFEB在脂類(lèi)代謝中的作用及其影響惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。該研究推斷TFEB-ERRα訊號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝，廣泛影響細(xì)胞膜功能，促使EC的侵襲和轉(zhuǎn)移。
研究材料與技巧
借助腫瘤基因組圖譜(TCGA)的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)TFEB和ERRα進(jìn)行剖析和驗(yàn)證。采用雙螢光素酶報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫沉淀定量聚合酶鏈反應(yīng)(ChIP-qPCR)評(píng)估TFEB-ERRα軸。通過(guò)體外功能失去和功能獲得實(shí)驗(yàn)來(lái)研究其機(jī)制。脂類(lèi)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)量TFEB-ERRα相關(guān)脂類(lèi)代謝途徑。掃描電鏡觀察假足。據(jù)悉，通過(guò)免疫組織物理和脂類(lèi)組學(xué)對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行驗(yàn)證ERRα相關(guān)脂類(lèi)。
結(jié)果
1、TFEB和ERRα在EC病人中高抒發(fā)，并與EC進(jìn)展相關(guān)。
研究在TCGARNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中的543例EC樣本和23例正常樣本中研究了這兩個(gè)基因的抒發(fā)和臨床病理數(shù)據(jù)。TFEB高抒發(fā)與癌癥進(jìn)展程度明顯相關(guān)(p0.05;圖1B)。據(jù)悉，TFEB高抒發(fā)的EC病人的總生存期(OS)高于低抒發(fā)的EC病人(p系數(shù)=0.168;p<0.001;圖1G)。
圖1生物信息學(xué)剖析顯示TFEB推動(dòng)ERRα轉(zhuǎn)錄參與EC進(jìn)展結(jié)果
2、ERRα是TFEB介導(dǎo)EC脂類(lèi)代謝的直接靶向。
螢光素酶活性測(cè)量顯示，TFEB的推動(dòng)明顯提高了ERRα抒發(fā)引起的相對(duì)螢光素酶活性(圖1H)。為了進(jìn)一步研究TFEB與ERRα之間的串導(dǎo)，研究進(jìn)行了ChIP-qPCR，結(jié)果否認(rèn)TFEB可以直接結(jié)合ERRαDNA的啟動(dòng)子(圖1I)。其中，器件序列為3’--5’的P5位點(diǎn)最有可能與TFEB結(jié)合(圖1J)。那些數(shù)據(jù)提示TFEB可以直接結(jié)合ERRα啟動(dòng)子并正向調(diào)節(jié)ERRα抒發(fā)。
ERRα是參與脂類(lèi)分解代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。對(duì)高、低ERRα抒發(fā)組進(jìn)行基因集富集剖析(GSEA)，闡述和鑒別ERRα在EC中的潛在功能。p<0.05，F(xiàn)DR<0.25被覺(jué)得明顯富集脂肪酸(FA)代謝和脂肪生成(圖1K)。該研究發(fā)覺(jué)FA代謝和脂肪生成途徑都與癌癥侵襲幾乎明顯相關(guān)(圖1L)，這表明脂類(lèi)代謝可能在EC的侵襲中起重要作用。
3、TFEB-ERRα主要影響富含甘油磷脂(GPs)的不飽和脂肪酸(UFA)
基于LC-MS/MS系統(tǒng)，篩選和鑒別了7類(lèi)脂類(lèi)，由1120種甘油磷脂(GPs)，345種鞘脂(SPs)，285種甘油脂(GLs)和其他脂質(zhì)組成(圖2A)。最后，測(cè)試了36類(lèi)脂類(lèi)，其中包括395種磷脂酰膽堿(PCs)，252種三甲基甘油(TAGs)，236磷脂酰乙酸胺(PEs)和其他脂類(lèi)物種(圖2B)。之后通過(guò)正交偏最小二乘判定剖析(OPLS-DA)評(píng)估脂類(lèi)組學(xué)變化。人卵巢內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)存在顯著的異質(zhì)性，(圖2C-D)。溶血磷脂酰乙酸胺(LPE)、二甘油酯(DG)、輔酶(Co)和蠟外物(WE)在KLE(TFEB–OV)中明顯減少。KLE(ERRα–OV)病人雙半乳糖二甲基甘油(DGDG)下降細(xì)胞膜流動(dòng)性，神經(jīng)節(jié)苷脂2(GM2)明顯減少。雖然PC和鞘磷脂(SM)隨TFEB或ERRα下降而變化不顯著，但用于評(píng)估細(xì)胞膜流動(dòng)性的KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)中PC/SM的比值均顯著下降(p<0.05，圖2E-F)。
作為T(mén)FEB的直接靶向，ERRα可明顯下降7種脂類(lèi)，包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰甘油(PGs)、心磷脂(CLs)、PE(18:1/20:5)、磷脂酰谷氨酸(PS)和神經(jīng)丙酯(Cers)。KLE(ERRα–OV)中還測(cè)量到富含UFA的PC、PG、PS、SMs、CLs和PE(18:1/20:5)降低，飽和脂肪酸(SFA)富含的PC、PG和SM(40:0)降低(圖2G)。據(jù)悉，KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)的重疊脂類(lèi)分別為PC(35:1)+H、PC(36:3)+H和PG(18:1/22:6)+H。
結(jié)果表明，ERRα的加入降低了KLE的膜流動(dòng)性。為此，TFEB驅(qū)動(dòng)ERRα提升GPs中脂肪硝基部份的不飽和度，進(jìn)而提高膜流動(dòng)性，促使侵襲和轉(zhuǎn)移。
圖2ERRα下降EC中含不飽和脂肪酸(UFA)的甘油磷脂(GPs)
4、與ERRα相關(guān)的蛋白/脂類(lèi)在EC的線粒體功能中富集
與對(duì)照組相比，用拮抗劑處理的KLE細(xì)胞獲得了173個(gè)與ERRα相關(guān)的蛋白。這種蛋白的生物學(xué)過(guò)程主要富集于線粒體功能，細(xì)胞成份富集于錐體球狀足生長(zhǎng)(圖3A)。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和脂類(lèi)組學(xué)剖析發(fā)覺(jué)，含UFA的PC、PG、SMs與含SFA的PC、PG、SMs之間有32個(gè)蛋白存在明顯差別(圖3B-C)。剖析主要富集了線粒體功能(圖3D)。
圖3與ERRα相關(guān)的蛋白/脂類(lèi)在EC的線粒體功能中富集
通常來(lái)說(shuō)，在KLE和ECC-1細(xì)胞中，所有基因都隨著TFEB-ERRα的下降而下調(diào)，隨著TFEB-ERRα的增加而上調(diào)(圖4A)。隨即，通過(guò)能量剖析儀評(píng)估線粒體應(yīng)激。與對(duì)照組相比，0.5μMFCCP處理的KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)細(xì)胞的最大耗氧率(OCR)下降，KLE(TFEB–KD)和KLE(ERRα–KD)細(xì)胞的最大耗氧率(OCR)增加(p<0.05)。KLE(TFEB?OV)和KLE(ERRα?OV)細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸量、最大呼吸量和備用呼吸量等OCR相關(guān)指標(biāo)均明顯下降(p<0.05)。同時(shí)，KLE(TFEB?KD)和KLE(ERRα?KD)細(xì)胞的基礎(chǔ)呼吸量、最大呼吸量和備用呼吸量均增長(zhǎng)(p<0.05)。ATP水平與TFEB、ERRα呈明顯正相關(guān)(p<0.05)。在ECC-1細(xì)胞中也觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)。為了進(jìn)一步否認(rèn)TFEB對(duì)ERRα介導(dǎo)的線粒體應(yīng)激的影響，處理后，KLE(TFEB?OV)細(xì)胞和ECC-1(TFEB?OV)細(xì)胞中的ERRα水平被抑制。KLE(TFEB?OV+)細(xì)胞和ECC-1(TFEB?OV+)細(xì)胞的OCR無(wú)明顯下降(p>0.05;圖4B)。
圖4與ERRα相關(guān)的蛋白/脂類(lèi)在EC的線粒體功能中富集
膜磷脂的脂肪硝基部份的飽和程度決定了細(xì)胞膜的生物化學(xué)性質(zhì)，如流動(dòng)性。和是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜中脂肪硝基部份飽和程度的關(guān)鍵磷脂重構(gòu)酶。因而，該研究測(cè)試了FA去飽和酶蛋白和。與對(duì)照組相比，KLE(ERRα?OV)中/3下降。
與對(duì)照組相比，和在KLE(ERRα?KD)中的抒發(fā)均增加(p<0.05)。同樣，測(cè)量ERRα后，MMP2和皮層肌動(dòng)蛋白()也會(huì)發(fā)生改變(p<0.05;圖4C)。
在ECC-1細(xì)胞中，/3、MMP2和皮層肌動(dòng)蛋白的抒發(fā)也有類(lèi)似的變化趨勢(shì)。據(jù)悉，用處理KLE和ECC-1后，/3、MMP2和皮層肌動(dòng)蛋白均顯著遭到抑制。但是，當(dāng)TFEB過(guò)抒發(fā)時(shí)，不能逆轉(zhuǎn)這種蛋白(p<0.05;圖4D).為了觀察假足的形成，研究發(fā)覺(jué)KLE(TFEB–OV)和KLE(ERRα–OV)細(xì)胞的絲足比KLE細(xì)胞多，而經(jīng)SCE處理后的KLE(ERRα–KD)和KLE細(xì)胞掃描到的細(xì)絲足較少。據(jù)悉，TFEB過(guò)抒發(fā)可去除的抑制作用，使球狀足和偽足得以保留。與KLE細(xì)胞偽足一致，TFEB-ERRα推動(dòng)絲足，醫(yī)治的結(jié)果可能因TFEB下調(diào)而撤消。(圖4E)這種數(shù)據(jù)表明，TFEB可以通過(guò)下調(diào)KLE和ECC-1細(xì)胞中的ERRα，誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激和磷脂重構(gòu)，因而提升細(xì)胞膜的流動(dòng)性。
5、TFEB通過(guò)EMT訊號(hào)通過(guò)ERRα推動(dòng)EC遷移
盡管ERRα在推動(dòng)EC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用已被否認(rèn)，但其潛在機(jī)制尚不清楚。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的策略調(diào)節(jié)TFEB或ERRα的抒發(fā)后，KLE和ECC-1細(xì)胞的遷移能力發(fā)生了明顯變化。與對(duì)照組相比，24h時(shí)KLE(TFEB–OV)、KLE(ERRα–OV)和ECC-1(TFEB–OV)的凹痕空間分別高達(dá)47.2%、21.9%和126.4%(p<0.05;圖5A-B)。24h時(shí)ECC-1(ERRα–OV)的凹痕空間也略有降低，但與對(duì)照組比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與對(duì)照組相比，KLE(TFEB–KD)和KLE(ERRα–KD)細(xì)胞的損傷間隙在24h時(shí)降低了近2倍(p<0.001)。在ECC-1(TFEB–KD)和ECC-1(ERRα–KD)中觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)。為了進(jìn)一步否認(rèn)TFEB對(duì)ERRα介導(dǎo)的細(xì)胞遷移的影響，處理后，KLE(TFEB–OV)細(xì)胞和ECC1(TFEB–OV)細(xì)胞的ERRα水平被抑制。KLE(TFEB?OV+)細(xì)胞和ECC-1(TFEB?OV+)細(xì)胞的凹痕空間在0~24h無(wú)明顯降低。
圖5TFEB通過(guò)EMT訊號(hào)通過(guò)ERRα推動(dòng)EC遷移
同時(shí)，經(jīng)處理后，KLE(TFEB–OV)和ECC-1(TFEB–OV)細(xì)胞提高的遷移能力部份破損(p<0.05;圖5A-B)。RT-qPCR結(jié)果顯示，上調(diào)TFEB可減少ECC-1和KLE細(xì)胞中ERRα和波形蛋白()的抒發(fā)，降低上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-)的抒發(fā)。相反，TFEB過(guò)抒發(fā)可提升ERRα和的抒發(fā)，增加E-的抒發(fā)(p<0.05，圖5C-D)。重要的是，10μM處理KLE(TFEB–OV)和ECC-1(TFEB–OV)細(xì)胞時(shí)，ERRα、和E-的抒發(fā)沒(méi)有明顯變化(p>0.05，圖5F)，這表明TFEB可以通過(guò)EMT訊號(hào)通路以ERRα依賴的形式調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移。
6、TFEB-ERRα的高抒發(fā)與EC病人血壓異常和轉(zhuǎn)移有關(guān)
為了驗(yàn)證上述結(jié)果，在EC組織微陣列(TMA)上進(jìn)行了免疫組化，其中包括79個(gè)EC標(biāo)本和32個(gè)正常卵巢內(nèi)膜標(biāo)本。
癌細(xì)胞和正常卵巢內(nèi)膜腺細(xì)胞核中均測(cè)量到TFEB陰性免疫反應(yīng)。EC組織的免疫反應(yīng)性顯著低于正常卵巢內(nèi)膜組織(p<0.001;圖6A)。同樣，在79個(gè)EC組織樣本中也測(cè)量到ERRα，其免疫反應(yīng)性低于在32個(gè)正常卵巢內(nèi)膜組織中測(cè)量到的ERRα(p<0.001;圖6A)。不同國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分期、組織學(xué)癌癥分級(jí)、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(LNM)情況下EC病人TFEB和ERRα抒發(fā)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05;圖6C)。但是，EC病人TFEB和ERRα抒發(fā)在≤1/2和>1/2肌層浸潤(rùn)(MI)組之間存在明顯差別(p<0.05;圖6C)。據(jù)悉，TFEB與ERRα免疫反應(yīng)性呈正相關(guān)。
有趣的是，在同一人群的血壓研究中，EC病人的血漿總膽固醇(TG)水平明顯低于健康人群，萊州度脂蛋白(HDL)和載脂蛋白a(APO-A)水平明顯高于健康人群。據(jù)悉，卵巢內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌(EEC)病人的低密度脂蛋白(LDL)水平顯著低于非卵巢內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌(NEEC)病人。重要的是，LNM病人的HDL和APO-A水平均明顯減少。接出來(lái)，該研究比較了不同TFEB/ERRα抒發(fā)水平人群的血壓差別。TFEB和ERRα高抒發(fā)組(++/+++)血漿HDL和APO-A水平顯著高于TFEB和ERRα低抒發(fā)組(-/+)(p<0.05;圖6D)。
綜上所述，TFEB-ERRα下降參與了EC的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與血漿HDL和APO-A水平的增加有關(guān)。
圖6幾種蛋白的免疫組織物理抒發(fā)及其相關(guān)性顯示
7、ERRα誘導(dǎo)的含UFA的GPs的積累是EC進(jìn)展所必需的
從32例EC組織和19例正常卵巢內(nèi)膜組織(3例不合格)中獲得的脂類(lèi)種類(lèi)，包括359個(gè)PCs,324個(gè)TAGs,269個(gè)PEs和其他脂類(lèi)種類(lèi)(圖7A-B)。Venn顯示，三組病人中均監(jiān)測(cè)到PG(18:1/22:6)+H、PC(36:3)+H兩種脂類(lèi)，KLE(ERRα–OV)和臨床組織中均測(cè)量到19種脂類(lèi)(圖7C)。通過(guò)OPLS-DA評(píng)估EC病人與正常對(duì)照組之間的系統(tǒng)性脂類(lèi)組學(xué)變化。人群之間存在顯著的異質(zhì)性(圖7D)。據(jù)悉，EC組織中磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰谷氨酸(LPS)、溶血磷脂酰乙酸胺(LPE)和PG，鞘脂(SLs)(、、Cer和乙酸神經(jīng)丙酯(CerP))以及單甘油酯(MG)和TG等GLs均下降。盡管SM下降不顯著，但EC組織中用于評(píng)價(jià)細(xì)胞膜流動(dòng)性的PC/SM明顯下降(p<0.05，圖7F)。據(jù)悉，EC組織中富含UFA的GP，如PC(18:1/18:2)+HCOO、PC(32:2)+H、PG(18:1/22:6)+H和SM(42:1)+HCOO與正常卵巢內(nèi)膜相比顯著下降(FC>1.5,VIP>1,p<0.05);圖7F)。但與非LNM病人相比，LNM病人的PC(18:1/18:2)+HCOO顯著低于非LNM病人(p<0.05;圖7G)。單誘因二元回歸剖析發(fā)覺(jué)，PC(18:1/18:2)+HCOO是晚期EC病人的獨(dú)立危險(xiǎn)誘因(p<0.05，圖7H)。
據(jù)悉，研究比較了不同PC(18:1/18:2)+HCOO抒發(fā)水平人群的血壓差別。結(jié)果表明,血漿萊州度脂蛋白水平低得多的高抒發(fā)病人PC(18:1/18:2)+HCOO比PC(18:1/18:2)+HCOO較低(p<0.05)。這種結(jié)果表明,ERRα誘導(dǎo)的PC(18:1/18:2)+HCOO降低是一種新的EC進(jìn)展生物標(biāo)志物,這可能與血漿萊州度脂蛋白的增加有關(guān)。
綜上所述，TFEB-ERRα軸推動(dòng)含UFA的GP積累，誘導(dǎo)以線粒體應(yīng)激為特點(diǎn)的脂類(lèi)重組，因而促使EC的侵襲和轉(zhuǎn)移。重要的是，含UFA的PC、SM和PG是EC細(xì)胞和組織中明顯改變的脂類(lèi)，其中，TFEB-ERRα軸誘導(dǎo)的PG(18:1/22:6)+H參與了癌癥發(fā)生，PC(18:1/18:2)+HCOO是介導(dǎo)EC轉(zhuǎn)移的ERRα依賴性脂類(lèi)。
圖7ERRα誘導(dǎo)富含ufa的GPs的積累是EC進(jìn)展所必需的
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該研究發(fā)覺(jué)TFEB-ERRα訊號(hào)通路通過(guò)EMT通路和細(xì)胞膜流動(dòng)性調(diào)控卵巢內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。這一調(diào)控依賴于ERRα參與脂類(lèi)代謝和細(xì)胞膜構(gòu)建。TFEB-ERRα降低了UFA-PCs,PG(18:1/22:6)+H和PC/SM比值，因而提高了細(xì)胞膜流動(dòng)性促使EC侵襲轉(zhuǎn)移。
END
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