使用說明:
1.打算試劑:溫度融解并混勻膜蛋白抽提試劑A和B,融解后立刻放在冰浴上。取適量的膜蛋白抽提試劑A和B備用,在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的最終含量為1mM。
2.打算細胞或組織樣品:
a.對于細胞
(1)搜集細胞
對于貼壁細胞:培養約2000-5000萬細胞,用PBS洗一遍,用細胞刮子刮下細胞或用富含EDTA但不含胰酶的細胞消化液處理細胞使細胞不再貼壁很緊,并用移液器吹打下細胞。離心搜集細胞,吸除上清,留下細胞沉淀備用。盡量避開用胰酶消化細胞,以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。
對于漂浮細胞:培養約2000-5000萬細胞,直接離心搜集細胞細胞膜蛋白,吸除上清,留下細胞沉淀備用。
(2)漂洗細胞:用適量冰浴預冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀,取少量細胞用于計數,剩余細胞4℃,600g離心5分鐘沉淀細胞。棄上清,此后4℃,600g離心1分鐘,以沉淀離心管管壁上的殘留液體并進一步沉淀細胞,盡最大努力吸盡殘留液體。
(3)細胞預處理:把1毫升臨用前添加了PMSF的膜蛋白抽提試劑A加入至2000-5000萬細胞中,輕輕并充分漂浮細胞,冰浴放置10-15分鐘。
b.對于組織:
取約100微克組織,用剪子盡量當心剪切成細小的組織碎片。加入1毫升臨用前添加了PMSF的膜蛋白抽提試劑A,輕輕漂浮組織碎片,冰浴放置10-15分鐘。注:假如組織樣品比較少,也可以使用更少的組織量,比如30-50mg細胞膜蛋白,后續試劑的藥量及操作步驟不變;組織藥量較少時,最后獲得的膜蛋白也較少。
3.細胞或組織樣品的破碎及破碎療效的鑒別:把細胞懸液或組織樣品轉移到一適當大小的冰浴預冷玻璃勻漿器中,勻漿約30-50下。勻漿療效與細胞類型和組織類型相關,不同細胞或組織所需的勻漿次數有所不同,需自行優化。一般可以在勻漿30次后取約2-3下挫細胞或組織勻漿液滴在蓋玻片上并在顯微鏡下觀察,如見細胞核周暈環(Ashinyringthe)或完整的細胞形態,說明細胞仍完整。假如有70-80%的細胞均無核周暈環和完整細胞形態,說明細胞早已充分破碎,則進行下一步實驗。否則,重新勻漿10-30次直至細胞起碼70%早已破碎。同時記錄對于該細胞的勻漿次數,一般在后續實驗時毋須再摸索勻漿次數。另外需注意特定的勻漿次數和勻漿器也有關,需同時注意記錄使用的是哪一個勻漿器。
注:假如沒有適當的玻璃勻漿器,對于培養的細胞也可以采用凍融法來破碎細胞。把步驟2中的樣品在液氮和溫度依次反復凍融兩次,之后取少量樣品在顯微鏡下檢查細胞破碎的程度。假如細胞破碎的程度不足70%,可降低凍融次數,直至細胞破碎的程度小于70%。
4.清除細胞核和未破碎的細胞:4℃,700g離心10分鐘,當心搜集堿液至一新的離心管中。汲取上清時請勿接觸沉淀!可以有約30-50下挫堿液殘留不予汲取,以保證汲取的堿液有較高的含量。
5.沉淀細胞膜碎片:4℃,離心30分鐘,以沉淀細胞膜碎片。
6.搜集細胞漿蛋白:汲取上清即為細胞漿蛋白,可-70℃保存備用。汲取上清時可以有30-50下挫上清殘留,以防止接觸沉淀造成上清樣品被污染。每5000萬細胞使用本產品裂解可獲得5-30mg細胞漿蛋白,不同細胞有所不同。
7.抽提膜蛋白:4℃,離心10秒,盡最大努力吸盡上清。可以輕輕碰觸到沉淀,甚至吞掉很少量的沉淀。加入膜蛋白抽提試劑B200下挫(如有必要,也可以加強到300下挫),最高速劇烈5秒重懸沉淀,冰浴5-10分鐘。重復前述步驟的和冰浴孵育1-2次,以充分抽提膜蛋白。隨即,4℃,離心5分鐘,搜集上清即為細胞膜蛋白堿液。可-70℃保存備用。對于一些有特殊用途的膜蛋白,可自行配制適當的膜蛋白抽提試劑進行膜蛋白抽提。每5000萬細胞使用本產品裂解可獲得0.3-3mg細胞膜蛋白,不同細胞有所不同。