使用說明：
1.打算試劑：溫度融解并混勻膜蛋白抽提試劑A和B，融解后立刻放在冰浴上。取適量的膜蛋白抽提試劑A和B備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終含量為1mM。
2.打算細(xì)胞或組織樣品：
a.對于細(xì)胞
(1)搜集細(xì)胞
對于貼壁細(xì)胞：培養(yǎng)約2000-5000萬細(xì)胞，用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞或用富含EDTA但不含胰酶的細(xì)胞消化液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心搜集細(xì)胞，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避開用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。
對于漂浮細(xì)胞：培養(yǎng)約2000-5000萬細(xì)胞，直接離心搜集細(xì)胞細(xì)胞膜蛋白，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
(2)漂洗細(xì)胞：用適量冰浴預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)，剩余細(xì)胞4℃，600g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。棄上清，此后4℃，600g離心1分鐘，以沉淀離心管管壁上的殘留液體并進(jìn)一步沉淀細(xì)胞，盡最大努力吸盡殘留液體。
(3)細(xì)胞預(yù)處理：把1毫升臨用前添加了PMSF的膜蛋白抽提試劑A加入至2000-5000萬細(xì)胞中，輕輕并充分漂浮細(xì)胞，冰浴放置10-15分鐘。
b.對于組織：
取約100微克組織，用剪子盡量當(dāng)心剪切成細(xì)小的組織碎片。加入1毫升臨用前添加了PMSF的膜蛋白抽提試劑A，輕輕漂浮組織碎片，冰浴放置10-15分鐘。注：假如組織樣品比較少，也可以使用更少的組織量，比如30-50mg細(xì)胞膜蛋白，后續(xù)試劑的藥量及操作步驟不變；組織藥量較少時，最后獲得的膜蛋白也較少。
3.細(xì)胞或組織樣品的破碎及破碎療效的鑒別：把細(xì)胞懸液或組織樣品轉(zhuǎn)移到一適當(dāng)大小的冰浴預(yù)冷玻璃勻漿器中，勻漿約30-50下。勻漿療效與細(xì)胞類型和組織類型相關(guān)，不同細(xì)胞或組織所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。一般可以在勻漿30次后取約2-3下挫細(xì)胞或組織勻漿液滴在蓋玻片上并在顯微鏡下觀察，如見細(xì)胞核周暈環(huán)(Ashinyringthe)或完整的細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞仍完整。假如有70-80%的細(xì)胞均無核周暈環(huán)和完整細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞早已充分破碎，則進(jìn)行下一步實驗。否則，重新勻漿10-30次直至細(xì)胞起碼70%早已破碎。同時記錄對于該細(xì)胞的勻漿次數(shù)，一般在后續(xù)實驗時毋須再摸索勻漿次數(shù)。另外需注意特定的勻漿次數(shù)和勻漿器也有關(guān)，需同時注意記錄使用的是哪一個勻漿器。
注：假如沒有適當(dāng)?shù)牟Ａ驖{器，對于培養(yǎng)的細(xì)胞也可以采用凍融法來破碎細(xì)胞。把步驟2中的樣品在液氮和溫度依次反復(fù)凍融兩次，之后取少量樣品在顯微鏡下檢查細(xì)胞破碎的程度。假如細(xì)胞破碎的程度不足70%，可降低凍融次數(shù)，直至細(xì)胞破碎的程度小于70%。
4.清除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞：4℃，700g離心10分鐘，當(dāng)心搜集堿液至一新的離心管中。汲取上清時請勿接觸沉淀！可以有約30-50下挫堿液殘留不予汲取，以保證汲取的堿液有較高的含量。
5.沉淀細(xì)胞膜碎片：4℃，離心30分鐘，以沉淀細(xì)胞膜碎片。
6.搜集細(xì)胞漿蛋白：汲取上清即為細(xì)胞漿蛋白，可-70℃保存?zhèn)溆谩＜橙∩锨鍟r可以有30-50下挫上清殘留，以防止接觸沉淀造成上清樣品被污染。每5000萬細(xì)胞使用本產(chǎn)品裂解可獲得5-30mg細(xì)胞漿蛋白,不同細(xì)胞有所不同。
7.抽提膜蛋白：4℃，離心10秒，盡最大努力吸盡上清。可以輕輕碰觸到沉淀，甚至吞掉很少量的沉淀。加入膜蛋白抽提試劑B200下挫(如有必要，也可以加強到300下挫)，最高速劇烈5秒重懸沉淀，冰浴5-10分鐘。重復(fù)前述步驟的和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。隨即，4℃，離心5分鐘，搜集上清即為細(xì)胞膜蛋白堿液。可-70℃保存?zhèn)溆谩τ谝恍┯刑厥庥猛镜哪さ鞍祝勺孕信渲七m當(dāng)?shù)哪さ鞍壮樘嵩噭┻M(jìn)行膜蛋白抽提。每5000萬細(xì)胞使用本產(chǎn)品裂解可獲得0.3-3mg細(xì)胞膜蛋白,不同細(xì)胞有所不同。
