DOI 號：10.1016/j..2022。
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概括：
藥物對生物反硝化的危害因過度使用而引起廣泛關(guān)注。 多粘菌素B（PMB）作為一種典型的抑菌肽，曾被視為消滅多重耐藥菌的“最后希望”，也在污水中被檢測到。 然而，人們對PMB對好氧反硝化的影響知之甚少。 本研究檢驗(yàn)了 PMB 對好氧反硝化性能的影響。 結(jié)果表明，0.50mg/LPMB將硫酸鹽去除率從97.4%提高到85.3%，并驅(qū)動反硝化器將更多的硫酸鹽轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)而不是形成氣態(tài)N。 活/死染色顯示 PMB 損壞的真菌膜。 轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步表明，PMB 抑制參與反硝化和有氧呼吸鏈的關(guān)鍵酶。 為了抵抗 PMB 應(yīng)激，反硝化菌會產(chǎn)生更厚的生物膜，以保護(hù)細(xì)胞免受 PMB 損傷，從而塑造中心碳代謝。 進(jìn)一步的研究表明，當(dāng) PMB 存在時，反硝化菌對各種碳源有不同的偏好。 此后，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝分析相結(jié)合，闡明了獨(dú)特的碳源偏好背后的機(jī)制。 總體而言，我們的數(shù)據(jù)表明反硝化菌在PMB處理?xiàng)l件下具有特殊的碳源偏好，提醒我們在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)謹(jǐn)慎選擇碳源。
研究背景：
由于藥物的過度使用，真菌耐藥性已驚人地降低。 同時，由于其高流動性和抗生物降解性，可通過廢水系統(tǒng)在廢水處理廠（WWTP）中逐漸積累。 多粘菌素B（B，PMB）作為一種典型的陽離子抑菌肽，甚至被認(rèn)為是治療多重耐藥菌的“最后希望”。 生物反硝化將硫酸鹽轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，被認(rèn)為是環(huán)境中主要的硫酸鹽還原過程，也是解決自然或工程生態(tài)系統(tǒng)中硫酸鹽污染的最經(jīng)濟(jì)的方法。 在好氧反硝化過程中，真菌使用氫和硫酸鹽作為電子受體。 藥物對好氧反硝化的不良反應(yīng)和抑制作用已被多次報(bào)道。 例如：4μg/L磺胺甲惡唑可嚴(yán)重抑制N2O還原，導(dǎo)致N2O排放量減少。 同時，當(dāng)磺胺甲惡唑含量降低（8-20μg/L）時，亞硫酸鹽積累最高，硫酸鹽被去除。 率較低。 AMP對好氧氨氧化真菌的毒性以及硝化序批式反應(yīng)器（SBR）的性能早已有報(bào)道，但關(guān)于AMP如何影響好氧反硝化的研究卻很少。
實(shí)驗(yàn)流程及評價指標(biāo)：
結(jié)果與討論：
1 PMB對好氧反硝化性能的影響
PMB的添加抑制了硫酸鹽的利用，并允許反硝化細(xì)菌將更多的硫酸鹽轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)。 添加0.25和0.50mg/L的PMB組中，二氧化碳和氮?dú)獾漠a(chǎn)值增加明顯，分別僅為17.12%和18.92%。 0.75mg/L PMB處理組可完全抑制好氧反硝化作用。 相應(yīng)地，PMB處理組的生物氮濃度和殘留NO3-N均低于對照組，表明PMB的添加抑制了硫酸鹽的利用，使反硝化細(xì)菌將更多的硫酸鹽轉(zhuǎn)化為生物量。 在反硝化過程中，優(yōu)選高氮損失和低生物質(zhì)形成。 研究結(jié)果表明PMB對兩者都有負(fù)面影響。
圖A：0.25mg/L和0.50mg/L的PMB處理組，PMB顯著抑制硫酸鹽還原，且時間滯后至少12小時。 0.50mg/LPMB對反硝化性能表現(xiàn)出較高的抑制作用，但最終NO3-N含量與0.25mg/LPMB處理相似。 對照組在60小時僅富含5.7mg/LNO3-N。 圖 B：NO2-N 的最大積累分別發(fā)生在 0 和 0.50 mg/LPMB 處理后 24 和 36 小時。 圖C：對照組僅保留2.57%的NO3-N，微量的NO2-N和NH4+-N殘留，54.95%的硫酸鹽轉(zhuǎn)化為生物氮（約37.84%的氮損失可能轉(zhuǎn)化為NO） 、N2O、N2等二氧化碳氮，最終擴(kuò)散到空氣中）。
2、PMB損害細(xì)胞膜完整性和好氧反硝化呼吸鏈
PMB 會損害細(xì)胞膜的完整性細(xì)胞膜損傷，較高水平的 PMB 會導(dǎo)致更大比例的細(xì)胞死亡。 用1、5和10 mg/LPMB處理后，細(xì)胞死亡率分別從2.0%下降至16.4%、23.1%和32.9%。 這一結(jié)果表明 PMB 損害了細(xì)胞膜的完整性，并且較高水平的 PMB 導(dǎo)致更大比例的細(xì)胞死亡。 這與最初研究的推論一致，即 AMP 靶向真菌膜帶負(fù)電荷的磷脂單層，然后引起非酶促破壞。
圖中的PI色素只有在細(xì)胞膜受損時才能進(jìn)入死細(xì)胞，形成藍(lán)色熒光，而SYTO9可以穿透膜完整或受損的細(xì)胞。
通過 RNA 測序，分析了在存在和不存在 0.50 mg/LPMB 的情況下脫氮假單胞菌中差異表達(dá)的基因。 本內(nèi)容是根據(jù)上述研究而選擇的。 PMB分子的結(jié)構(gòu)特征使其能夠直接結(jié)合并插入膜單層中形成孔，從而對錨定在內(nèi)膜上的一系列蛋白質(zhì)造成損害，包括反硝化酶和有氧呼吸酶。 據(jù)報(bào)道，0.50mg/L PMB顯著抑制編碼NAR、NOS、復(fù)合物I、復(fù)合物III和部分復(fù)合物IV的基因的表達(dá)水平。 與反硝化酶相比，PMB 下調(diào)了編碼復(fù)合物 I 和復(fù)合物 III 的基因以及編碼復(fù)合物 IV 亞基的基因的表達(dá)水平（見右圖）。 PMB通過抑制反硝化酶的表達(dá)和硫酸鹽的利用來阻礙反硝化作用，使反硝化細(xì)菌進(jìn)行有氧呼吸形成能量。
在反硝化過程中，硫酸鹽必須通過特殊的硫酸鹽/亞硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NarK進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后被NAR還原為亞硫酸鹽。 亞硫酸鹽通過NarK返回周質(zhì)，然后逐漸還原為N2。 還看圖 B，編碼 NarK 的基因受到 PMB 的強(qiáng)烈抑制。 抑制 NarK 合成會增加硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)效率，從而增加 NAR 還原酶催化的硫酸鹽還原。 根據(jù)這一結(jié)果，推斷反硝化需要更多不同的酶復(fù)合物并消耗更多的能量。 有氧反硝化細(xì)菌更傾向于進(jìn)行有氧呼吸而不是反硝化。
圖A，真菌的好氧反硝化作用是借助電子傳遞鏈進(jìn)行的，包括圖中的復(fù)合物I和III、醌體、細(xì)胞色素C和一系列反硝化酶。 電子通過四個關(guān)鍵組件進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，并最終通過有氧呼吸和反硝化呼吸這兩個電子傳遞途徑進(jìn)行消化。 這些高度分支的呼吸鏈?zhǔn)刮⑸锬軌蚪⒏行У耐緩絹磉m應(yīng)環(huán)境條件。
3. 不同PMB劑量對真菌生長和生物膜產(chǎn)生的影響
當(dāng)用不同劑量的PMB處理時，真菌具有更長的初始生長階段和更低的最終顏色。 然而，當(dāng)真菌進(jìn)入對數(shù)生長期后，各PMB含量下的生長速度沒有顯著差異。 真菌生物膜的產(chǎn)生是介導(dǎo)藥物應(yīng)激的一種策略，因?yàn)樽鳛楸Ｗo(hù)繭的 EPS 濃度降低可能會阻礙藥物滲透到生物膜中，從而抑制藥物分子。 不同的藥物對真菌生物膜的產(chǎn)生和 EPS 的形成可能有不同的影響。 細(xì)胞外蛋白產(chǎn)量先減少后增加。 這一結(jié)果與之前的研究一致。 推測可能是因?yàn)檎婢鸁o法承受如此高含量的藥物。
4. PMB重建脫氮假單胞菌的碳代謝
原始研究表明，為了抵抗PMB脅迫，假單胞菌反硝化細(xì)菌產(chǎn)生了更厚的生物膜。 生物膜的產(chǎn)生與多種功能基因的表達(dá)密切相關(guān)。 因此，進(jìn)行KEGG分析以進(jìn)一步解釋差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能。 受PMB影響的主要途徑包括以下代謝相關(guān)途徑。 這表明真菌重組碳代謝并產(chǎn)生更多能量來抵抗PMB脅迫。
用0.50mg/LPMB處理后，獼猴桃糖、果糖和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，這與KEGG通路富集結(jié)果一致，而（箭頭）C4二酐鹽，如琥珀酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，均被上調(diào)。 。 先前的研究表明碳源對于反硝化性能至關(guān)重要。 與以獼猴桃糖為碳源的系統(tǒng)相比，磷酸鹽支持的系統(tǒng)具有更高的反硝化率和反硝化真菌的相對產(chǎn)量，乙酸、甲醇也是更有利于好氧反硝化的碳源。 上述結(jié)果表明，在 PMB 處理的系統(tǒng)中，反硝化細(xì)菌似乎更喜歡碳水化合物而不是有機(jī)酸。 這些不同的碳源偏好可以從另一個角度解釋為什么PMB導(dǎo)致氣氮產(chǎn)量減少和反硝化效率降低，但碳源偏好的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。
5 PMB對反硝化真菌碳源偏好的影響
為了說明不同碳源對好氧反硝化的影響，選取這7種碳源，括號內(nèi)標(biāo)明圖片中的顏色，反硝化假單胞菌的碳依然在0.50mg/LPMB條件下進(jìn)行評價來源偏好。 通常的情況是真菌在不同碳源條件下有相似的生長趨勢，但細(xì)胞密度不同。 PMB處理12-24小時后，除磷酸鹽系統(tǒng)（黃色）外，真菌生長表現(xiàn)出明顯的延遲。 約48小時時，海藻糖（藍(lán)色）和蔗糖（綠色）系統(tǒng)的最終真菌細(xì)胞密度在0.50mg/LPMB組和對照組（原圖）之間幾乎沒有差異，而獼猴桃糖（黑色） 、甘油（紫色）和琥珀酸鈉（亮藍(lán)色）（底部三條）細(xì)胞生長受到 PMB 的強(qiáng)烈抑制。 這一結(jié)果表明不同的碳源條件在脫氮假單胞菌的PMB耐受性中起著關(guān)鍵作用。
硫醇鹽（黃色）、甘油（紫色）、葡萄糖（黑灰色）、海藻糖（藍(lán)色）和蔗糖（綠色）系統(tǒng)具有相似的反硝化效率（范圍內(nèi)為 87-91%）。 其中，磷酸鹽系統(tǒng)（黃色）的反硝化效率最高，生物量產(chǎn)量最低，表明磷酸鹽是好氧反硝化的最佳碳源，這與之前的研究一致。 當(dāng)添加0.50 mg/LPMB時，琥珀酸、甘油、葡萄糖和磷酸鹽體系的反硝化受到強(qiáng)烈抑制，分別增加到17.7%、21.3%、33.8%和51.6%。 相比之下，海藻糖（藍(lán)色）和蔗糖（綠色）系統(tǒng)的除濁效率幾乎不受PMB影響，盡管二氧化碳氮的形成顯著減少。 上述結(jié)果表明，當(dāng)面臨PMB脅迫時，碳水化合物，尤其是二糖，更適合反硝化細(xì)菌。 結(jié)果與之前的工作一致，主要是由于其固有的化學(xué)和物理特性，可以作為生物保護(hù)劑來保護(hù)生物分子或細(xì)胞免受一系列應(yīng)激，并且還可以隔離PMB的作用。
6 碳源偏好的潛在機(jī)制
為了抵抗PMB脅迫細(xì)胞膜損傷，真菌下調(diào)了編碼參與糖酵解途徑和TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶的基因的表達(dá)，這些酶在圖中以紅色標(biāo)記。 由于PMB的抗菌機(jī)制，同樣位于細(xì)胞內(nèi)膜的琥珀酸酯酶（EC+1.3.5.1&EC:1.3.5.4）的表達(dá)水平受到強(qiáng)烈抑制（左下紅色）。 根據(jù)代謝組學(xué)分析，PMB組琥珀酸的積累是對照組的1.42倍。 一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果是，編碼琥珀酰輔酶A合成酶（EC：6.2.1.5）的基因表達(dá)水平也上調(diào)，琥珀酰輔酶A的積累在PMB處理組中增加了1.22倍。對照組的情況。 作為TCA循環(huán)的重要中間體，琥珀絡(luò)合物的積累必然導(dǎo)致TCA循環(huán)的減弱。
我們來看一下對產(chǎn)能的影響：（中圖和下圖）糖酵解有三個步驟形成ATP或NADH，TCA循環(huán)有五個步驟。 （在 TCA 中）事實(shí)上，由于五個能量形成步驟中的四個受到強(qiáng)烈抑制，PMB 顯著抑制了 TCA 循環(huán)中含能量中間體的形成。 相比之下，（中圖）PMB 對糖酵解能量形成步驟的影響相當(dāng)溫和，僅甘油醛-3-P 酯酶（EC：1.2.1.12）（右上）被抑制（0.78 倍，即不錯）。 為此，不同碳源在中心碳代謝中的位置對于細(xì)胞形成能量至關(guān)重要。 正因?yàn)槿绱耍赑MB存在的情況下，琥珀酸鈉成為最不優(yōu)選的碳源，因?yàn)樵赥CA循環(huán)中，琥珀酸鈉之后只剩下兩個能量形成步驟，更不用說參與這兩個步驟的酶被抑制，但由于 PMB 應(yīng)激，琥珀胺在細(xì)胞中積聚。 不僅獼猴桃糖和琥珀酸，其他碳源也可以通過不同的途徑進(jìn)入糖酵解或TCA循環(huán)（圖上半部分）。 然而（右上）甘油途徑的最后一步，編碼乙酸三糖異構(gòu)酶（EC：55.3.1.1）的基因的表達(dá)水平被PMB抑制，導(dǎo)致低碳源的使用。 基本上，直接參與TCA循環(huán)的碳源，如磷酸鹽、琥珀胺和柚子復(fù)合物，已被證明是反硝化的最佳碳源。 然而，當(dāng)面臨PMB的壓力時，反硝化菌更喜歡比其他研究的碳源形成更多能量和含能量中間體的碳水化合物，因此當(dāng)藥物存在碳源時，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇好氧反硝化。
圖中，催化酶下調(diào)、下調(diào)和非差異表達(dá)的基因分別用黑色、藍(lán)色和白色標(biāo)記。 下調(diào)和上調(diào)基因的混合物標(biāo)記為紅色。
推理：
PMB抑制好氧反硝化，導(dǎo)致硫酸鹽去除效率低、二氧化碳和氮產(chǎn)量低。 PMB 抑制好氧反硝化作用的主要機(jī)制有兩種。 一方面，PMB可以破壞細(xì)胞膜的完整性，從而直接破壞位于內(nèi)膜上的電子傳遞鏈的關(guān)鍵酶。 另一方面，為了抵消 PMB 應(yīng)激，真菌形成了更厚的生物膜，以保護(hù)細(xì)胞免受藥物的攻擊。 因此，在 PMB 存在的情況下，真菌經(jīng)歷了碳代謝的重塑，以形成更多的 EPS 和能量，從而產(chǎn)生顯著的碳源偏好。 值得注意的是，反硝化菌更喜歡碳水化合物，尤其是二糖（即海藻糖、蔗糖），因?yàn)镻MB引起琥珀酸積累和TCA循環(huán)減弱。 該研究首次闡明了PMB對好氧反硝化的抑制機(jī)制，為實(shí)際應(yīng)用中優(yōu)化好氧反硝化性能提供了有益的參考。