目的研究分離、培養大鼠骨髓血管內皮祖細胞的方式并對其進行誘導分化鑒別，為臨床進行缺血性疾患的取代醫治奠定細胞學基礎。方式用灌注法分離大鼠骨髓血管內皮祖細胞，用血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子誘導其分化，形態學觀察細胞的生長過程，并借助抗CD34抗原鑒別血管內皮祖細胞，借助抗vWF抗原、抗eNOS抗原鑒別血管內皮細胞。結果大鼠骨髓血管內皮祖細胞可在體外培養條件下貼壁生長，可誘導分化為抒發特異性組織蛋白的內皮細胞。推論在大鼠骨髓內可分離出骨髓源性血管內皮祖細胞，呈貼壁增殖狀態，并有分化能力。
血管內皮祖細胞;血管內皮細胞;骨髓源性;分化
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骨髓中的血管內皮祖細胞(，EPCs)可以穿行到外傷組織出席新血管產生，并能分化為內皮細胞(，ECs)，促使局部血管生成和血管新生。目前已有研究者將EPCs用于醫治缺血性疾患，并取得了良好的醫治療效，具有再生和分化能力的EPCs已漸漸成為醫治血管系統疾患的理想細胞材料〔1〕。而且，目前EPCs主要通過外周血進行提取，這些方式獲取的細胞數目較少，而骨髓來源的EPCs研究報導不多。本研究從BALB/c大鼠分離骨髓源性EPCs，在體外進行培養擴增，誘導其分化細胞膜色譜，構建一套完整的骨髓源性EPCs的分離、培養、誘導分化和鑒別的方式，為其作為細胞材料醫治血管外傷方面提供根據。
1材料與技巧
1.1實驗材料BALB/c大鼠，6～8w齡，雄雌不限，由四川學院醫學部基礎實驗植物部提供，SPF級;DMEM/F12(1∶1)培養基、胎牛血漿由Gibco公司提供;內皮細胞生長因子(r，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(，bFGF)由Sigma公司提供;纖維聯接蛋白(FN)由上海鼎國公司提供;抗CD34抗原、抗vWF抗原、抗eNOS、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒由博士德公司提供;6孔一次性培養板、10cm一次性培養皿由Costa公司提供。
1.2EPCs的分離與培養〔2〕BALB/c大鼠斷頸處決后，放在75%酒精曝曬殺菌5min。無菌條件下分離脛骨，除去胸肌組織，用1ml注射器汲取1ml無血漿DMEM/F12培養基，從肱骨一端進針進行沖洗，反復3次，充分沖出骨髓組織，用200目碳鋼篩網進行碾壓，分離成單個細胞。用無血漿DMEM/F12離心，棄堿液，2ml無血漿培養液重懸細胞加入到淋巴細胞分離液上離心，1500r/min，30min。用吸管吸出中間黑色云霧狀細胞帶，培養液漂洗2次。用DMEM/F12培養液(為基礎培養基細胞膜色譜，bFGF和VEGF終含量均為10ng/ml)調節細胞終含量為5×105/ml，接種到預鋪有纖連蛋白10cm培養皿，37℃、5%CO2培養箱中進行培養，每3天換液1次。
1.3EPCs的誘導分化鑒別〔3〕將培養細胞接種于預先置有蓋玻片(多聚賴谷氨酸處理過)的6孔培養板中進行培養，并加入含bFGF和VEGF的DMEM/F12培養基進行誘導分化，于
4、20d后分別用乙醇固定，進行免疫細胞物理染色觀察EPCs的分化。具體步驟如下：3%H2O2水孵育5～10min，以清除內源性胺基化物酶活性;滴加封閉用正常綿羊血漿工作液，溫度孵育10～15min，傾去，勿洗;滴加1∶100的一抗37℃孵育3h，PBS沖洗(3min×3次);滴加兔抗小鼠二抗，37℃孵育10min，PBS洗(3min×3次);滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10min，PBS沖洗(3min×3次)。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水充分沖洗,脫水,透明,中性樹脂封片并鏡檢。
2結果
2.1骨髓源性EPCs的培養從骨髓分離的細胞接種于培養基后，約2d開始貼壁，呈梭樣或三角形樣下降，4d后細胞生長速率開始增快，約10d開始出現集落樣生長狀態，有梭形細胞從集落伸開，相互聯接成片(圖1)，約18～20d細胞相互融合，呈鋪路石樣狀態。
2.2EPCs及ECs的細胞免疫物理鑒別未加VEGF和bFGF的EPCs免疫物理染色顯示CD34陰性反應,培養的部份細胞表面上帶有均勻的黑色顆粒(圖2A)。培養10d經VEGF和bFGF誘導后，部份細胞vWF和eNOS染色均呈陰性(圖2B，圖2C)。
3討論
當前，和老齡化密切相關的動脈粥樣硬化、腦缺血、心肌缺血、腦梗塞和心肌梗塞等病癥發病率日漸增高。研究發覺，在這種病癥的恢復過程中，高齡老化導致機體血管發育能力障礙，血管生長因子合成降低，血管內皮細胞功能異常，對細胞因子的反應力也上漲。目前已有植物實驗研究移植EPCs醫治動脈粥樣硬化和腦梗塞，降低內皮細胞在這種病癥血液循環中的動員及增殖，結果表明內皮祖細胞對根治這兩種癌癥有著積極的作用〔4～6〕。
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