【摘要】：目的：本課題是以β1腎上腺素受體(β1-AR)作為抗生素篩選的靶向,通過構建高抒發(fā)β1,-AR/CMC模型,并與UPLC/MS進行聯(lián)用,篩選、鑒定出桑寄生中作用于β1-AR的活性成份；通過測定活性化合物對cAMP及PKA的抑制作用,篩選高選擇性β1-AR抑制劑,并考察其抗細胞自噬的作用。課題所構建的剖析方式,為快速有效篩選草藥作用于β1-AR的活性成份開辟新途徑,對草藥創(chuàng)新抗生素的研究與開發(fā)具有極其重要的意義。方式：首先,本課題采用免疫印跡及流式細胞技術測量β1-AR抒發(fā)；其次,將細胞膜結合到硅膠表面,制備高抒發(fā)的β1-AR細胞膜固定相,考察固定相色譜特點及穩(wěn)定性,構建細胞膜色譜(CMC)模型；再度,完善β1AR/CMC--UPLC/MS剖析方式細胞膜色譜,考察色譜系統(tǒng)的特異性和可靠性,并篩選、鑒定桑寄生中作用于β1-AR的活性成份；最后,測定了桑寄生中活性化合物對β1-AR的相關下游訊號因子cAMP及PKA抒發(fā)水平的影響,考察活性化合物對β1-AR的抑制作用,因而篩選高選擇性的β1-AR抑制劑,同時細胞膜色譜,檢查其抗細胞自噬作用。結果：本文成功建立β1-AR/pEGFP-N1喂奶植物抒發(fā)引物,并通過脂類體轉染至CHO-S細胞,經G418篩選和流式細胞儀分選后獲得的β1-AR/CHO-S細胞具有顯著的紅色螢光,且經激光共聚焦顯微鏡分層掃描可見,β1-AR蛋白抒發(fā)定位在細胞膜上；轉染的β1-AR/CHO-S細胞能得到80KD左右的融合蛋白帶,分子量大小與目的蛋白一致；同時流式細胞法測量結果顯示,經多次篩選得到的β1-AR/CHO-S細胞,其陰性率為96.31%±8.7%。
采用高抒發(fā)β1-AR/CHO-S細胞制備CMC柱的固定相,構建β1AR/CMC--UPLC/MS剖析方式。采用美托洛爾和異丙腎上腺素作為陰性對照考察β1-AR/CMC色譜特點,結果表明抗生素分子與膜蛋白β1-AR的才能互相作用,具有生物親合色譜特點,但是經流動相的磨蝕,用本文方式制備的β1-AR/CMSP上的細胞膜仍能均勻分布,不易流失。采用尼群地平(NT)和美托洛爾(METO)的混和標準堿液考察β1AR/CMC--UPLC/MS方式的辨識、分離和鑒別能力,在β1AR/CMC模型上與細胞膜受體互相作用的組分可以選擇性地保留出來,而無作用的雜質成份則被直接排出色譜柱,相應保留組分的結構可以由UPLC/MS進行鑒別。本文采用p,AR/CMC--UPLC/MS剖析方式篩選草藥桑寄生提取物中作用于β1-AR的活性成份,經鑒別,保留的主要組分通過UPLC/MS鑒別為異歐黃芩素。競爭實驗結果表明,異歐黃芩素與美托洛爾競爭結合細胞膜受體,說明其在細胞膜上的結合位點有部份重疊。體外毒理實驗證明,與對照組相比,異歐黃芩素和美托洛爾對cAMP及PKA均具有抑制作用(P0.01),并能抑制由ISO導致的細胞自噬。推論：我們構建了β1AR/CMC--UPLC/MS的剖析方式,可用于篩選草藥等復雜體系中作用于p1-AR的活性成份。β1-AR/CMC模型還能增強靶點受體抗生素篩選的有效性和特異性,為有效篩選草藥作用于β1-AR的活性成份提供新的技術手段,對草藥創(chuàng)新抗生素的研究與開發(fā)具有極其重要的意義。
