【摘要】：目的：本課題是以β1腎上腺素受體(β1-AR)作為抗生素篩選的靶向,通過構(gòu)建高抒發(fā)β1,-AR/CMC模型,并與UPLC/MS進(jìn)行聯(lián)用,篩選、鑒定出桑寄生中作用于β1-AR的活性成份；通過測(cè)定活性化合物對(duì)cAMP及PKA的抑制作用,篩選高選擇性β1-AR抑制劑,并考察其抗細(xì)胞自噬的作用。課題所構(gòu)建的剖析方式,為快速有效篩選草藥作用于β1-AR的活性成份開辟新途徑,對(duì)草藥創(chuàng)新抗生素的研究與開發(fā)具有極其重要的意義。方式：首先,本課題采用免疫印跡及流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量β1-AR抒發(fā)；其次,將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面,制備高抒發(fā)的β1-AR細(xì)胞膜固定相,考察固定相色譜特點(diǎn)及穩(wěn)定性,構(gòu)建細(xì)胞膜色譜(CMC)模型；再度,完善β1AR/CMC--UPLC/MS剖析方式細(xì)胞膜色譜,考察色譜系統(tǒng)的特異性和可靠性,并篩選、鑒定桑寄生中作用于β1-AR的活性成份；最后,測(cè)定了桑寄生中活性化合物對(duì)β1-AR的相關(guān)下游訊號(hào)因子cAMP及PKA抒發(fā)水平的影響,考察活性化合物對(duì)β1-AR的抑制作用,因而篩選高選擇性的β1-AR抑制劑,同時(shí)細(xì)胞膜色譜,檢查其抗細(xì)胞自噬作用。結(jié)果：本文成功建立β1-AR/pEGFP-N1喂奶植物抒發(fā)引物,并通過脂類體轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞,經(jīng)G418篩選和流式細(xì)胞儀分選后獲得的β1-AR/CHO-S細(xì)胞具有顯著的紅色螢光,且經(jīng)激光共聚焦顯微鏡分層掃描可見,β1-AR蛋白抒發(fā)定位在細(xì)胞膜上；轉(zhuǎn)染的β1-AR/CHO-S細(xì)胞能得到80KD左右的融合蛋白帶,分子量大小與目的蛋白一致；同時(shí)流式細(xì)胞法測(cè)量結(jié)果顯示,經(jīng)多次篩選得到的β1-AR/CHO-S細(xì)胞,其陰性率為96.31%±8.7%。
采用高抒發(fā)β1-AR/CHO-S細(xì)胞制備CMC柱的固定相,構(gòu)建β1AR/CMC--UPLC/MS剖析方式。采用美托洛爾和異丙腎上腺素作為陰性對(duì)照考察β1-AR/CMC色譜特點(diǎn),結(jié)果表明抗生素分子與膜蛋白β1-AR的才能互相作用,具有生物親合色譜特點(diǎn),但是經(jīng)流動(dòng)相的磨蝕,用本文方式制備的β1-AR/CMSP上的細(xì)胞膜仍能均勻分布,不易流失。采用尼群地平(NT)和美托洛爾(METO)的混和標(biāo)準(zhǔn)堿液考察β1AR/CMC--UPLC/MS方式的辨識(shí)、分離和鑒別能力,在β1AR/CMC模型上與細(xì)胞膜受體互相作用的組分可以選擇性地保留出來,而無作用的雜質(zhì)成份則被直接排出色譜柱,相應(yīng)保留組分的結(jié)構(gòu)可以由UPLC/MS進(jìn)行鑒別。本文采用p,AR/CMC--UPLC/MS剖析方式篩選草藥桑寄生提取物中作用于β1-AR的活性成份,經(jīng)鑒別,保留的主要組分通過UPLC/MS鑒別為異歐黃芩素。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,異歐黃芩素與美托洛爾競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞膜受體,說明其在細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)有部份重疊。體外毒理實(shí)驗(yàn)證明,與對(duì)照組相比,異歐黃芩素和美托洛爾對(duì)cAMP及PKA均具有抑制作用(P0.01),并能抑制由ISO導(dǎo)致的細(xì)胞自噬。推論：我們構(gòu)建了β1AR/CMC--UPLC/MS的剖析方式,可用于篩選草藥等復(fù)雜體系中作用于p1-AR的活性成份。β1-AR/CMC模型還能增強(qiáng)靶點(diǎn)受體抗生素篩選的有效性和特異性,為有效篩選草藥作用于β1-AR的活性成份提供新的技術(shù)手段,對(duì)草藥創(chuàng)新抗生素的研究與開發(fā)具有極其重要的意義。
