【摘要】：肺炎居疾病死亡首位,近些年來癌癥的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈持續(xù)上升的趨勢,而這一趨勢在中國尤其顯著。明晰其發(fā)生、發(fā)展機制和開發(fā)出有效的根治方式對醫(yī)學(xué)發(fā)展和人類健康越來越重要。本研究對臨床腫瘤患者血清及腹腔囊腫中溶血磷脂酸(LPA)含量進行檢查,明晰LPA在腫瘤患者中的抒發(fā)情況。以人肺腫瘤Calu-3細(xì)胞為研究對象,觀察LPA對肺腫瘤Calu-3細(xì)胞的增殖、遷移及CFTR離子通道的影響細(xì)胞膜離子通道,并闡述了其作用機制,為癌癥的醫(yī)治提供實驗數(shù)據(jù)和理論根據(jù)。本實驗首先,采用ELISA(LPA)試劑盒測量腫瘤、肺炎及結(jié)核性腹膜炎患者血清及腹腔囊腫中LPA的含量,結(jié)果發(fā)覺:哮喘病人血清及腹腔囊腫中LPA含量較氣胸和結(jié)核性腹膜炎患者血清及腹腔囊腫中LPA含量明顯降低,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。采用CCK8實驗測量LPA對Calu-3細(xì)胞增殖能力的影響,通過凹痕實驗測量LPA對Calu-3細(xì)胞遷移能力的影響,流式細(xì)胞儀測量LPA對肺腫瘤Calu-3細(xì)胞周期的變化,實驗結(jié)果顯示:LPA才能促使Calu-3細(xì)胞的增殖和遷移,并降低細(xì)胞周期過程中S期的細(xì)胞數(shù)目。為進一步觀察LPA對Calu-3細(xì)胞增殖和遷移的影響,我們采用螢光定量PCR技術(shù)觀察了LPA對細(xì)胞增殖、遷移和自噬相關(guān)基因:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、D1、CDK2、p53的影響。
實驗結(jié)果顯示:隨著LPA含量的降低,Calu-3細(xì)胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和D1、CDK2的mRNA抒發(fā)明顯降低,而p53mRNA抒發(fā)水平明顯升高。LPA通過與細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮其作用。G蛋白大致分為Gs、Gi和Gq家族,麻疹毒素(PTX)是Gi蛋白的特異性阻斷劑,本研究在Calu-3細(xì)胞中加入PTX后發(fā)覺:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和D1、CDK2的mRNA抒發(fā)未見降低,p53mRNA抒發(fā)亦未見回升。據(jù)悉,我們還采用blot技術(shù)檢查了Calu-3細(xì)胞中細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白VEGF、HIF-1ɑ、PCNA、c-myc、D1、CDK2、p53的變化。實驗結(jié)果顯示:LPA才能下調(diào)Calu-3細(xì)胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、D1和CDK2蛋白的抒發(fā),上調(diào)p53蛋白抒發(fā),從蛋白水平上進一步說明LPA才能促使Calu-3細(xì)胞的增殖和遷移。有研究報導(dǎo),CFTR離子通道在抑制癌癥細(xì)胞增殖方面有一定作用,我們通過免疫螢光和激光共聚焦顯微鏡實驗觀察到在肺囊腫Calu-3細(xì)胞膜上存在CFTR蛋白抒發(fā)細(xì)胞膜離子通道,因而采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察了不同含量LPA對Calu-3細(xì)胞膜CFTR離子通道電壓的影響。
結(jié)果發(fā)覺:5、10、20μmol/L的LPA作用于Calu-3細(xì)胞后,CFTR離子通道電壓較LPA未處理組具有不同程度的減少。以上結(jié)果表明,LPA才能降低Calu-3細(xì)胞的CFTR通道電壓,這可能是LPA推動Calu-3細(xì)胞增殖的機制之一。為進一步研究LPA對Calu-3細(xì)胞膜上的CFTR離子通道的影響,我們采用細(xì)胞免疫螢光、blot的方式測量了LPA對細(xì)胞膜上CFTR蛋白抒發(fā)的影響,結(jié)果發(fā)覺:外源給予LPA才能增加細(xì)胞膜上CFTR蛋白的抒發(fā),這與我們之前檢查到的LPA減少Calu-3細(xì)胞膜上的CFTR通道電壓結(jié)果相一致。本研究還發(fā)覺Gi蛋白阻斷劑PTX才能抑制Calu-3細(xì)胞中LPA造成的CFTR電壓降低,否認(rèn)Gi蛋白參與了LPA作用于Calu-3細(xì)胞的過程。我們采用免疫螢光法、blot的方式測量了細(xì)胞膜上LPA受體LPA2的抒發(fā),結(jié)果發(fā)覺:Calu-3細(xì)胞存在LPA2蛋白的抒發(fā),而LPA2是Gi蛋白家族中最主要的膜蛋白之一,這就提示LPA通過作用于細(xì)胞膜上的LPA2受體發(fā)揮作用,進一步證明:LPA通過作用于細(xì)胞膜上的LPA2受體,從而推動肺腫瘤細(xì)胞Calu3增殖、遷移和侵襲。
本研究首先明晰了癌癥病人血清及腹腔囊腫中LPA含量顯著低于哮喘和結(jié)核性腹膜炎病人,說明LPA與癌癥有著密切的關(guān)系。同時從體外實驗證明LPA能促使腎病Calu-3細(xì)胞的增殖和遷移,降低細(xì)胞周期過程中S期的細(xì)胞數(shù)目。并證明了LPA才能降低促使細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的抒發(fā),增加自噬相關(guān)基因的抒發(fā)。并且借助膜片鉗技術(shù)與blot否認(rèn)了LPA能減少Calu-3細(xì)胞的CFTR通道電壓、降低細(xì)胞膜上CFTR蛋白的抒發(fā)。我們的研究結(jié)果提示LPA在肺腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用,為癌癥的靶點醫(yī)治提供了新的思路及理論根據(jù)