【摘要】：肺炎居疾病死亡首位,近些年來癌癥的發病率在全球范圍內仍呈持續上升的趨勢,而這一趨勢在中國尤其顯著。明晰其發生、發展機制和開發出有效的根治方式對醫學發展和人類健康越來越重要。本研究對臨床腫瘤患者血清及腹腔囊腫中溶血磷脂酸(LPA)含量進行檢查,明晰LPA在腫瘤患者中的抒發情況。以人肺腫瘤Calu-3細胞為研究對象,觀察LPA對肺腫瘤Calu-3細胞的增殖、遷移及CFTR離子通道的影響細胞膜離子通道,并闡述了其作用機制,為癌癥的醫治提供實驗數據和理論根據。本實驗首先,采用ELISA(LPA)試劑盒測量腫瘤、肺炎及結核性腹膜炎患者血清及腹腔囊腫中LPA的含量,結果發覺:哮喘病人血清及腹腔囊腫中LPA含量較氣胸和結核性腹膜炎患者血清及腹腔囊腫中LPA含量明顯降低,差別具有統計學意義(P0.05)。采用CCK8實驗測量LPA對Calu-3細胞增殖能力的影響,通過凹痕實驗測量LPA對Calu-3細胞遷移能力的影響,流式細胞儀測量LPA對肺腫瘤Calu-3細胞周期的變化,實驗結果顯示:LPA才能促使Calu-3細胞的增殖和遷移,并降低細胞周期過程中S期的細胞數目。為進一步觀察LPA對Calu-3細胞增殖和遷移的影響,我們采用螢光定量PCR技術觀察了LPA對細胞增殖、遷移和自噬相關基因:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、D1、CDK2、p53的影響。
實驗結果顯示:隨著LPA含量的降低,Calu-3細胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和D1、CDK2的mRNA抒發明顯降低,而p53mRNA抒發水平明顯升高。LPA通過與細胞表面的G蛋白偶聯受體結合發揮其作用。G蛋白大致分為Gs、Gi和Gq家族,麻疹毒素(PTX)是Gi蛋白的特異性阻斷劑,本研究在Calu-3細胞中加入PTX后發覺:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和D1、CDK2的mRNA抒發未見降低,p53mRNA抒發亦未見回升。據悉,我們還采用blot技術檢查了Calu-3細胞中細胞增殖和轉移相關蛋白VEGF、HIF-1ɑ、PCNA、c-myc、D1、CDK2、p53的變化。實驗結果顯示:LPA才能下調Calu-3細胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、D1和CDK2蛋白的抒發,上調p53蛋白抒發,從蛋白水平上進一步說明LPA才能促使Calu-3細胞的增殖和遷移。有研究報導,CFTR離子通道在抑制癌癥細胞增殖方面有一定作用,我們通過免疫螢光和激光共聚焦顯微鏡實驗觀察到在肺囊腫Calu-3細胞膜上存在CFTR蛋白抒發細胞膜離子通道,因而采用全細胞膜片鉗技術觀察了不同含量LPA對Calu-3細胞膜CFTR離子通道電壓的影響。
結果發覺:5、10、20μmol/L的LPA作用于Calu-3細胞后,CFTR離子通道電壓較LPA未處理組具有不同程度的減少。以上結果表明,LPA才能降低Calu-3細胞的CFTR通道電壓,這可能是LPA推動Calu-3細胞增殖的機制之一。為進一步研究LPA對Calu-3細胞膜上的CFTR離子通道的影響,我們采用細胞免疫螢光、blot的方式測量了LPA對細胞膜上CFTR蛋白抒發的影響,結果發覺:外源給予LPA才能增加細胞膜上CFTR蛋白的抒發,這與我們之前檢查到的LPA減少Calu-3細胞膜上的CFTR通道電壓結果相一致。本研究還發覺Gi蛋白阻斷劑PTX才能抑制Calu-3細胞中LPA造成的CFTR電壓降低,否認Gi蛋白參與了LPA作用于Calu-3細胞的過程。我們采用免疫螢光法、blot的方式測量了細胞膜上LPA受體LPA2的抒發,結果發覺:Calu-3細胞存在LPA2蛋白的抒發,而LPA2是Gi蛋白家族中最主要的膜蛋白之一,這就提示LPA通過作用于細胞膜上的LPA2受體發揮作用,進一步證明:LPA通過作用于細胞膜上的LPA2受體,從而推動肺腫瘤細胞Calu3增殖、遷移和侵襲。
本研究首先明晰了癌癥病人血清及腹腔囊腫中LPA含量顯著低于哮喘和結核性腹膜炎病人,說明LPA與癌癥有著密切的關系。同時從體外實驗證明LPA能促使腎病Calu-3細胞的增殖和遷移,降低細胞周期過程中S期的細胞數目。并證明了LPA才能降低促使細胞增殖和轉移相關基因和蛋白的抒發,增加自噬相關基因的抒發。并且借助膜片鉗技術與blot否認了LPA能減少Calu-3細胞的CFTR通道電壓、降低細胞膜上CFTR蛋白的抒發。我們的研究結果提示LPA在肺腫瘤的發生及發展中發揮重要作用,為癌癥的靶點醫治提供了新的思路及理論根據