膜片鉗與單細胞RTPCR技術相結合應用于神經細胞研究進展[摘要]膜片鉗與單細胞RT-PCR技術相結合應用于神經細胞的研究，從電生理學和分子生物學角度闡明了神經細胞功能活動與結構之間的相互聯系，使單個神經細胞離子通道的生物化學學和毒理學特點得以表現，同時可以在同一細胞篩選出特異性的mRNA抒發。目前，這兩種技術的結合已有多方面的應用，并取得了重要的進展。[關鍵詞]神經細胞；膜片鉗技術；單細胞RT-PCR[中圖分類號]R34[文獻標示碼]A[文章編號]1673-7210（2008）04（a）-015-02膜片鉗技術(patch-clamp)是1976年由Neher和[1]在電流鉗基礎上發展而至的一種記錄細胞膜離子通道電生理活動的技術。后經[2]等進一步建立，其電壓檢測靈敏度已達1PA,空間幀率達1m，時間幀率達10s，并已發展出許多適宜不同須要的記錄模式。它能區分通過細胞膜單個通道的電壓,對通道濁度及其動力學特點、藥理學特點和調節機制進行研究，為通道分型提供了可靠標準；同時它擴充了電生理技術的應用范圍，往年無法研究的喂奶類植物小細胞或延性很大的細胞等，均可采用膜片鉗技術進行研究。
另外，應用膜片鉗技術還可確切檢測出與細胞分泌相關的膜電容的微小變化，因此它還是一種研究細胞分泌機制的電生理新方式。聚合酶鏈式反應（chain,PCR）技術是一種在體外由質粒介導的特定DNA序列的酶擴增，能快速特異的擴增所需目的基因或DNA片斷，是一種用途廣泛且有效的核苷酸擴增技術。目前，PCR技術已廣泛應用于基因分離、克隆和核苷酸序列剖析，突變體和重組體建立，基因抒發調控研究及基因多態性剖析等。RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）與cDNA的PCR相結合的技術。首先經反轉錄酶作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片斷。RT-PCR技術靈敏且用途廣泛，可用于測量細胞中基因抒發水平，細胞中RNA病毒濃度和直接克隆特定基因的cDNA序列。膜片鉗與單細胞RT-PCR相結合的目的是為了確定單細胞內多基因抒發的形式。該技術應用于神經細胞的研究,從電生理學和分子生物學角度闡明了神經細胞功能活動與結構之間的相互聯系,使單個神經細胞離子通道的生物化學學和毒理學特點得以表現，同時可以在同一細胞篩選出特異性的mRNA抒發。1基本原理等[3]于1991年首先將膜片鉗與單細胞RT-PCR技術結合上去，具體方式是:將逆轉錄酶、dNTP(DNA合成底物)及質粒等在膜片鉗記錄之前加到電極內液中，使細胞內mRNA在膜片鉗記錄過程中即被逆轉錄生成cDNA，之后對生成的cDNA進行PCR擴增細胞膜片，擴增產物通過凝膠電泳進行剖析。
這兩種技術的結合可對形態相像而電活動不同的細胞作出分子水平的解釋。1995年，法國耶魯學院醫大學的和耶魯學院的[4]在刊物上發表文章，首次介紹了膜片鉗與單細胞RT-PCR技術結合在單個神經元研究中的應用，在完成對神經元離子通道的毒理學和生物化學學特點觀察后，研究同一細胞上特異mRNAs的抒發情況。其具體操作是:在嚴格避免RNA酶污染的條件下先完成全細胞膜片鉗記錄，再將該細胞內容物吸入到記錄電極中,之后用所研究的離子通道亞單位特異性質粒將取自單細胞的mRNA逆轉錄成cDNA后進行PCR擴增，從而測量特異的mRNA。膜片鉗技術既可以對單細胞電生理功能進行研究，又可以利用其電極產生的吸收通道，汲取單個細胞，對其進行單細胞水平的分子生物學研究。依靠于膜片鉗電極，在相差顯微鏡觀察下，直接用電極將待選定的單個細胞汲取下來，將其轉到管，之后進行RT-PCR.2研究進展2.1剖析神經元離子通道等[5]運用膜片鉗和單細胞RT-PCR技術，對成年鼠額葉和顳葉蒲肯野神經元中的CaV2.1轉錄本進行抒發剖析，發覺單個腦干蒲肯野細胞即使抒發多種CaV2.1轉錄本，但其種類比腦干中的少。
他提出不同類型的CaV2.1轉錄本可在不同腦區和腦神經元中進行選擇性抒發。I等[6]應用膜片鉗和單細胞RT-PCR研究2種不同類型喂奶植物的可激動細胞（海馬神經元和非神經毛發囊狀上皮細胞），發覺在這兩種細胞中Nav1.2mRNA和Nav1.6mRNA抒發最多,而Nav1.3mRNA和Nav1.7mRNA分別在胚胎海馬神經細胞和嬰兒的毛發囊狀上皮細胞有適度抒發。Liu等[7]應用膜片鉗和單細胞RT-PCR技術，在分離的2~5個月的SD雌性小鼠前舌蕈狀嗅覺體會器細胞上研究延后檢波鉀(DRK)通道的抒發，發覺其上有許多種來自KCNA,KCNB和KCNC亞家族的DRK通道，其中Kv1.5通道(KCNA5)是蕈狀嗅覺體會器細胞主要的DRK通道。2.2觀察神經元受體分布等[8]應用膜片鉗和單細胞RT-PCR技術剖析新生幼鼠腦干交感神經元固醇受體mRNA的抒發，觀察到75％交感節前神經元抒發H1受體的mRNA而未抒發H2，H3和H4受體的mRNA。該研究首次報導了交感節前神經元中抒發H1受體，并猜測胺類通過對H1受體直接的突觸后效應對交感節前神經元的激動性進行調節。
JuliaE.Fries等[9]應用膜片鉗和單細胞RT-PCR技術研究增殖性玻璃體黃斑腫瘤患者黃斑Müller細胞中P2Y受體亞型的類型，發覺Müller細胞抒發P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6受體。OA等[10]在急性分離的TM神經元中,運用全細胞膜片鉗和單細胞RT-PCR技術研究AMPA受體特點。發覺所有神經元上都有AMPA受體GLUR2的mRNA，75%的神經元有GLUR1的mRNA，其次是GLUR4（56%）,GLUR3（0％）。2.3剖析神經元的分子基礎L等[11]運用膜片鉗、單細胞RT-PCR及無監督降維剖析方式,根據電生理特點和分子參數的不同把小鼠側燕麥核神經元分成五類。第一類是投射神經元，這種神經元具有低領取頻度，對常年去極化剌激具有頻度適應性等電生理特點并抒發囊泡膜丁酸轉運體1（）。其依據電緊張性的不同和是否存在血管活性腸肽（VIP）又分classIA和classIB兩類。其余四類都是富含氨酸脫羧酶(GAD67)的中間神經元。第二類神經元形成快速棘波，并伴有一些初期的頻度適應。第三類神經元無頻度適應而形成快速棘波，它與第兩類神經元的區別在于前者存在VIP和相對較少的神經肽Y(NPY)及生長抑素(SOM)。
第四類和第五類通過分子標記不能明晰區別，但可依照膜電位值和棘波圖形的不同進行分辨。HüK等[12]通過膜片鉗和單細胞RT-PCR技術研究頑固性腦膜腦炎患者的側燕麥核神經元特點，發覺投射性神經元具有棘狀樹突,不同程度頻度適應性的動作電位和γ-羧基谷氨酸受體耦聯的外向檢波K+通道(Kir)。而中間神經元的樹突無棘或極少棘,動作電位小且經常是自發的,且無γ-羧基谷氨酸受體。單細胞RT-PCR發覺，在投射神經元中抒發Kir通道亞型Kir3.1和Kir3.2及囊泡膜丁酸轉運體和；而中間神經元也抒發Kir通道亞型Kir3.1和Kir3.2，但其缺少和受體。結果表明,依據形態學、電生理和分子生物學標準可以分辨人腦燕麥核投射神經元和中間神經元。2.4研究抗生素對神經細胞的作用ZhongCB等[13]運用全細胞膜片鉗和單細胞RT-PCR技術剖析急性分離的東莨菪堿誘導的認知缺損的小鼠海馬錐體神經元延后檢波鉀電壓的特點以闡明由膽堿能損傷造成記憶缺位的離子機制。他發覺海馬錐體神經元IK電壓密度減小、振幅峰值變高；Kv2.1mRNA降低,而Kv1.5mRNA沒有顯著的改變，提示海馬錐體細胞Kv2.1mRNA抒發降低可能是IK降低的緣由及東莨菪堿誘導記憶缺陷的離子基礎。
MarkFry等[14]應用全細胞膜片鉗和單細胞RT-PCR技術剖析了對小鼠最后區（AP）神經元的作用，觀察到60％小鼠AP神經元對敏感，且對敏感的所有AP神經元均抒發and兩種受體。3展望膜片鉗與單細胞RT-PCR技術相結合應用于神經科學領域的研究,從分子生物學和電生理角度闡明了神經細胞的功能活動與結構之間的相互聯系，也促使檢查單個細胞的基因改變成為可能。該技術才能精確地研究特定單細胞的基因抒發，成為研究功能基因組學的有力工具。而許多癌癥的發生都是因為單個細胞的分子改變導致的，因而確切地找到發生改變的細胞對于癌癥的確診、機制的研究及預防都有重要的意義。但因為對技術的高度要求以及對外界干擾的高度敏感細胞膜片，單細胞RT-PCR的應用遭到了一定的限制。為此這項技術在體系上有待于進一步的建立，在應用上有待于進一步的擴充。[參考文獻][1]NeherE,B.-fromoffrog[J].,1976,260(5554):799-802.[2]OP,MartyA,NeherE,eta1.patch-clampforhigh-fromcellsandcell-free[J].Arch,1981,391(2):85-100.[3]J,YehH,K,eta1.ofgeneinLive[J].PANS,1992,89:3010-3014.[4]NJ,DL.PCRandpatch-clampof[J].,1995,14(6):1095-1100.[5],W.,C.Payne,aofCav2.1incellsthaninthe[J].,2006,24(2):86-96.[6]I,F,C,eta1.of-gatedalphainandnon-cells[J].,2005,130(2)：389-396.[7]Liu,DaneR,,Kim,eta1.andofK+inrattastebuds[J].Cell,2005,289:C868-C880.[8]AD,AM,LeeK,eta1.ratinvitroviaofH1[J].,2006,95(4):2492-2500.[9]JuliaE.Fries,IwonaM.,-,eta1.ofP2YinHumanMüllerGlialCellsby,CellRT-PCR,and[J].VisSci,2005;46:3000-3007.[10]OA,BT,VS,eta1.AMPAandwith-inrat[J].,2004,19(4),957-965.[11]L,MeisS,G,eta1.ofandintheratbasedupon[J].And2006,33(1):57-67.[12]HüK,-HankeD,G,eta1.andofinthehuman[J].And,2006,31(2):210-217.[13]ZhongCB，PanYP，TongXY,eta1.andKv2.1mRNAinof--rats[J].,2005,373(2):99-104.[14]MarkFry,M.Smith,TedD.Hoyda,eta1.AreaArebythe[J].Theof,2006,26(38):9695-9702.（收稿日期：2007-10-16）