膜片鉗與單細(xì)胞RTPCR技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞研究進(jìn)展[摘要]膜片鉗與單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞的研究，從電生理學(xué)和分子生物學(xué)角度闡明了神經(jīng)細(xì)胞功能活動(dòng)與結(jié)構(gòu)之間的相互聯(lián)系，使單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞離子通道的生物化學(xué)學(xué)和毒理學(xué)特點(diǎn)得以表現(xiàn)，同時(shí)可以在同一細(xì)胞篩選出特異性的mRNA抒發(fā)。目前，這兩種技術(shù)的結(jié)合已有多方面的應(yīng)用，并取得了重要的進(jìn)展。[關(guān)鍵詞]神經(jīng)細(xì)胞；膜片鉗技術(shù)；單細(xì)胞RT-PCR[中圖分類號(hào)]R34[文獻(xiàn)標(biāo)示碼]A[文章編號(hào)]1673-7210（2008）04（a）-015-02膜片鉗技術(shù)(patch-clamp)是1976年由Neher和[1]在電流鉗基礎(chǔ)上發(fā)展而至的一種記錄細(xì)胞膜離子通道電生理活動(dòng)的技術(shù)。后經(jīng)[2]等進(jìn)一步建立，其電壓檢測(cè)靈敏度已達(dá)1PA,空間幀率達(dá)1m，時(shí)間幀率達(dá)10s，并已發(fā)展出許多適宜不同須要的記錄模式。它能區(qū)分通過(guò)細(xì)胞膜單個(gè)通道的電壓,對(duì)通道濁度及其動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)、藥理學(xué)特點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究，為通道分型提供了可靠標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)它擴(kuò)充了電生理技術(shù)的應(yīng)用范圍，往年無(wú)法研究的喂奶類植物小細(xì)胞或延性很大的細(xì)胞等，均可采用膜片鉗技術(shù)進(jìn)行研究。
另外，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)還可確切檢測(cè)出與細(xì)胞分泌相關(guān)的膜電容的微小變化，因此它還是一種研究細(xì)胞分泌機(jī)制的電生理新方式。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（chain,PCR）技術(shù)是一種在體外由質(zhì)粒介導(dǎo)的特定DNA序列的酶擴(kuò)增，能快速特異的擴(kuò)增所需目的基因或DNA片斷，是一種用途廣泛且有效的核苷酸擴(kuò)增技術(shù)。目前，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因分離、克隆和核苷酸序列剖析，突變體和重組體建立，基因抒發(fā)調(diào)控研究及基因多態(tài)性剖析等。RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）與cDNA的PCR相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片斷。RT-PCR技術(shù)靈敏且用途廣泛，可用于測(cè)量細(xì)胞中基因抒發(fā)水平，細(xì)胞中RNA病毒濃度和直接克隆特定基因的cDNA序列。膜片鉗與單細(xì)胞RT-PCR相結(jié)合的目的是為了確定單細(xì)胞內(nèi)多基因抒發(fā)的形式。該技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞的研究,從電生理學(xué)和分子生物學(xué)角度闡明了神經(jīng)細(xì)胞功能活動(dòng)與結(jié)構(gòu)之間的相互聯(lián)系,使單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞離子通道的生物化學(xué)學(xué)和毒理學(xué)特點(diǎn)得以表現(xiàn)，同時(shí)可以在同一細(xì)胞篩選出特異性的mRNA抒發(fā)。1基本原理等[3]于1991年首先將膜片鉗與單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)結(jié)合上去，具體方式是:將逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP(DNA合成底物)及質(zhì)粒等在膜片鉗記錄之前加到電極內(nèi)液中，使細(xì)胞內(nèi)mRNA在膜片鉗記錄過(guò)程中即被逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，之后對(duì)生成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增細(xì)胞膜片，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行剖析。
這兩種技術(shù)的結(jié)合可對(duì)形態(tài)相像而電活動(dòng)不同的細(xì)胞作出分子水平的解釋。1995年，法國(guó)耶魯學(xué)院醫(yī)大學(xué)的和耶魯學(xué)院的[4]在刊物上發(fā)表文章，首次介紹了膜片鉗與單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)結(jié)合在單個(gè)神經(jīng)元研究中的應(yīng)用，在完成對(duì)神經(jīng)元離子通道的毒理學(xué)和生物化學(xué)學(xué)特點(diǎn)觀察后，研究同一細(xì)胞上特異mRNAs的抒發(fā)情況。其具體操作是:在嚴(yán)格避免RNA酶污染的條件下先完成全細(xì)胞膜片鉗記錄，再將該細(xì)胞內(nèi)容物吸入到記錄電極中,之后用所研究的離子通道亞單位特異性質(zhì)粒將取自單細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而測(cè)量特異的mRNA。膜片鉗技術(shù)既可以對(duì)單細(xì)胞電生理功能進(jìn)行研究，又可以利用其電極產(chǎn)生的吸收通道，汲取單個(gè)細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行單細(xì)胞水平的分子生物學(xué)研究。依靠于膜片鉗電極，在相差顯微鏡觀察下，直接用電極將待選定的單個(gè)細(xì)胞汲取下來(lái)，將其轉(zhuǎn)到管，之后進(jìn)行RT-PCR.2研究進(jìn)展2.1剖析神經(jīng)元離子通道等[5]運(yùn)用膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)，對(duì)成年鼠額葉和顳葉蒲肯野神經(jīng)元中的CaV2.1轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行抒發(fā)剖析，發(fā)覺(jué)單個(gè)腦干蒲肯野細(xì)胞即使抒發(fā)多種CaV2.1轉(zhuǎn)錄本，但其種類比腦干中的少。
他提出不同類型的CaV2.1轉(zhuǎn)錄本可在不同腦區(qū)和腦神經(jīng)元中進(jìn)行選擇性抒發(fā)。I等[6]應(yīng)用膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR研究2種不同類型喂奶植物的可激動(dòng)細(xì)胞（海馬神經(jīng)元和非神經(jīng)毛發(fā)囊狀上皮細(xì)胞），發(fā)覺(jué)在這兩種細(xì)胞中Nav1.2mRNA和Nav1.6mRNA抒發(fā)最多,而Nav1.3mRNA和Nav1.7mRNA分別在胚胎海馬神經(jīng)細(xì)胞和嬰兒的毛發(fā)囊狀上皮細(xì)胞有適度抒發(fā)。Liu等[7]應(yīng)用膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)，在分離的2~5個(gè)月的SD雌性小鼠前舌蕈狀嗅覺(jué)體會(huì)器細(xì)胞上研究延后檢波鉀(DRK)通道的抒發(fā)，發(fā)覺(jué)其上有許多種來(lái)自KCNA,KCNB和KCNC亞家族的DRK通道，其中Kv1.5通道(KCNA5)是蕈狀嗅覺(jué)體會(huì)器細(xì)胞主要的DRK通道。2.2觀察神經(jīng)元受體分布等[8]應(yīng)用膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)剖析新生幼鼠腦干交感神經(jīng)元固醇受體mRNA的抒發(fā)，觀察到75％交感節(jié)前神經(jīng)元抒發(fā)H1受體的mRNA而未抒發(fā)H2，H3和H4受體的mRNA。該研究首次報(bào)導(dǎo)了交感節(jié)前神經(jīng)元中抒發(fā)H1受體，并猜測(cè)胺類通過(guò)對(duì)H1受體直接的突觸后效應(yīng)對(duì)交感節(jié)前神經(jīng)元的激動(dòng)性進(jìn)行調(diào)節(jié)。
JuliaE.Fries等[9]應(yīng)用膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)研究增殖性玻璃體黃斑腫瘤患者黃斑M(jìn)üller細(xì)胞中P2Y受體亞型的類型，發(fā)覺(jué)Müller細(xì)胞抒發(fā)P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6受體。OA等[10]在急性分離的TM神經(jīng)元中,運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)研究AMPA受體特點(diǎn)。發(fā)覺(jué)所有神經(jīng)元上都有AMPA受體GLUR2的mRNA，75%的神經(jīng)元有GLUR1的mRNA，其次是GLUR4（56%）,GLUR3（0％）。2.3剖析神經(jīng)元的分子基礎(chǔ)L等[11]運(yùn)用膜片鉗、單細(xì)胞RT-PCR及無(wú)監(jiān)督降維剖析方式,根據(jù)電生理特點(diǎn)和分子參數(shù)的不同把小鼠側(cè)燕麥核神經(jīng)元分成五類。第一類是投射神經(jīng)元，這種神經(jīng)元具有低領(lǐng)取頻度，對(duì)常年去極化剌激具有頻度適應(yīng)性等電生理特點(diǎn)并抒發(fā)囊泡膜丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（）。其依據(jù)電緊張性的不同和是否存在血管活性腸肽（VIP）又分classIA和classIB兩類。其余四類都是富含氨酸脫羧酶(GAD67)的中間神經(jīng)元。第二類神經(jīng)元形成快速棘波，并伴有一些初期的頻度適應(yīng)。第三類神經(jīng)元無(wú)頻度適應(yīng)而形成快速棘波，它與第兩類神經(jīng)元的區(qū)別在于前者存在VIP和相對(duì)較少的神經(jīng)肽Y(NPY)及生長(zhǎng)抑素(SOM)。
第四類和第五類通過(guò)分子標(biāo)記不能明晰區(qū)別，但可依照膜電位值和棘波圖形的不同進(jìn)行分辨。HüK等[12]通過(guò)膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)研究頑固性腦膜腦炎患者的側(cè)燕麥核神經(jīng)元特點(diǎn)，發(fā)覺(jué)投射性神經(jīng)元具有棘狀樹(shù)突,不同程度頻度適應(yīng)性的動(dòng)作電位和γ-羧基谷氨酸受體耦聯(lián)的外向檢波K+通道(Kir)。而中間神經(jīng)元的樹(shù)突無(wú)棘或極少棘,動(dòng)作電位小且經(jīng)常是自發(fā)的,且無(wú)γ-羧基谷氨酸受體。單細(xì)胞RT-PCR發(fā)覺(jué)，在投射神經(jīng)元中抒發(fā)Kir通道亞型Kir3.1和Kir3.2及囊泡膜丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和；而中間神經(jīng)元也抒發(fā)Kir通道亞型Kir3.1和Kir3.2，但其缺少和受體。結(jié)果表明,依據(jù)形態(tài)學(xué)、電生理和分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可以分辨人腦燕麥核投射神經(jīng)元和中間神經(jīng)元。2.4研究抗生素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用ZhongCB等[13]運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)剖析急性分離的東莨菪堿誘導(dǎo)的認(rèn)知缺損的小鼠海馬錐體神經(jīng)元延后檢波鉀電壓的特點(diǎn)以闡明由膽堿能損傷造成記憶缺位的離子機(jī)制。他發(fā)覺(jué)海馬錐體神經(jīng)元IK電壓密度減小、振幅峰值變高；Kv2.1mRNA降低,而Kv1.5mRNA沒(méi)有顯著的改變，提示海馬錐體細(xì)胞Kv2.1mRNA抒發(fā)降低可能是IK降低的緣由及東莨菪堿誘導(dǎo)記憶缺陷的離子基礎(chǔ)。
MarkFry等[14]應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)剖析了對(duì)小鼠最后區(qū)（AP）神經(jīng)元的作用，觀察到60％小鼠AP神經(jīng)元對(duì)敏感，且對(duì)敏感的所有AP神經(jīng)元均抒發(fā)and兩種受體。3展望膜片鉗與單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究,從分子生物學(xué)和電生理角度闡明了神經(jīng)細(xì)胞的功能活動(dòng)與結(jié)構(gòu)之間的相互聯(lián)系，也促使檢查單個(gè)細(xì)胞的基因改變成為可能。該技術(shù)才能精確地研究特定單細(xì)胞的基因抒發(fā)，成為研究功能基因組學(xué)的有力工具。而許多癌癥的發(fā)生都是因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞的分子改變導(dǎo)致的，因而確切地找到發(fā)生改變的細(xì)胞對(duì)于癌癥的確診、機(jī)制的研究及預(yù)防都有重要的意義。但因?yàn)閷?duì)技術(shù)的高度要求以及對(duì)外界干擾的高度敏感細(xì)胞膜片，單細(xì)胞RT-PCR的應(yīng)用遭到了一定的限制。為此這項(xiàng)技術(shù)在體系上有待于進(jìn)一步的建立，在應(yīng)用上有待于進(jìn)一步的擴(kuò)充。[參考文獻(xiàn)][1]NeherE,B.-fromoffrog[J].,1976,260(5554):799-802.[2]OP,MartyA,NeherE,eta1.patch-clampforhigh-fromcellsandcell-free[J].Arch,1981,391(2):85-100.[3]J,YehH,K,eta1.ofgeneinLive[J].PANS,1992,89:3010-3014.[4]NJ,DL.PCRandpatch-clampof[J].,1995,14(6):1095-1100.[5],W.,C.Payne,aofCav2.1incellsthaninthe[J].,2006,24(2):86-96.[6]I,F,C,eta1.of-gatedalphainandnon-cells[J].,2005,130(2)：389-396.[7]Liu,DaneR,,Kim,eta1.andofK+inrattastebuds[J].Cell,2005,289:C868-C880.[8]AD,AM,LeeK,eta1.ratinvitroviaofH1[J].,2006,95(4):2492-2500.[9]JuliaE.Fries,IwonaM.,-,eta1.ofP2YinHumanMüllerGlialCellsby,CellRT-PCR,and[J].VisSci,2005;46:3000-3007.[10]OA,BT,VS,eta1.AMPAandwith-inrat[J].,2004,19(4),957-965.[11]L,MeisS,G,eta1.ofandintheratbasedupon[J].And2006,33(1):57-67.[12]HüK,-HankeD,G,eta1.andofinthehuman[J].And,2006,31(2):210-217.[13]ZhongCB，PanYP，TongXY,eta1.andKv2.1mRNAinof--rats[J].,2005,373(2):99-104.[14]MarkFry,M.Smith,TedD.Hoyda,eta1.AreaArebythe[J].Theof,2006,26(38):9695-9702.（收稿日期：2007-10-16）