PAGEPAGE5膜片鉗記錄系統(tǒng)儀器簡(jiǎn)介：膜片鉗技術(shù)是細(xì)胞電生理方面的低端技術(shù)，是研究細(xì)胞膜離子通道的重要工具。目前細(xì)胞膜離子通道的研究早已應(yīng)用到了抗生素作用、環(huán)境對(duì)細(xì)胞膜離子通道的影響、神經(jīng)網(wǎng)路研究以及癌癥的確診和醫(yī)治等多個(gè)領(lǐng)域。膜片鉗技術(shù)是神經(jīng)科學(xué)、心血管、藥物學(xué)和藥效學(xué)、功能基因組學(xué)和許多遺傳病深入研究的有力手段。儀器名稱(chēng)：膜片鉗記錄剖析系統(tǒng)主要設(shè)備：PC-2B放大器、放大器、正置顯微鏡、倒置顯微鏡、NIR-DIC成像系統(tǒng)、水鏡頭、微操縱器、微電極拉制儀、拋光儀、振動(dòng)切塊機(jī)等。儀器功能及應(yīng)用范圍：?jiǎn)?strong>細(xì)胞膜片鉗記錄（急性分離細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞）、腦片膜片鉗記錄（盲法、可視法）收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：培訓(xùn)費(fèi)：1個(gè)月以內(nèi)—500元；1~3個(gè)月—1000元。指導(dǎo)操作：院內(nèi)20元/小時(shí)，院外40元/小時(shí)。獨(dú)立操作：院內(nèi)60元/天，院外120元/天（由兩位指導(dǎo)老師認(rèn)可培訓(xùn)合格，方可進(jìn)行獨(dú)立操作）。開(kāi)放時(shí)間：周三至周日管理規(guī)定：⑴膜片鉗記錄剖析系統(tǒng)屬于高檔精密儀器，因而任何步入本室進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的人員，必須經(jīng)過(guò)本室專(zhuān)門(mén)人員培訓(xùn)合格認(rèn)可后，經(jīng)準(zhǔn)許方可進(jìn)行膜片鉗放大器、微操縱器、拉制儀、切片機(jī)、顯微鏡等儀器的操作。
⑵在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，必須嚴(yán)格根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作，不得私自修改操作步驟，不許自行調(diào)改儀器設(shè)置細(xì)胞膜片，以免引起儀器損毀。⑶儀器損毀賠付事宜根據(jù)我室賠付制度進(jìn)行處理。⑷統(tǒng)一安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間細(xì)胞膜片，使用儀器后作登記。⑸實(shí)驗(yàn)人員負(fù)責(zé)當(dāng)日的水電安全和室內(nèi)衛(wèi)生。腦片膜片鉗實(shí)驗(yàn)流程(PC-2B)一、腦片制做配制新鮮蔗糖氨水（4°C）和NaCl孵育液（溫度，20~25°C）各1L。用乙醇曝曬刀片30min。麻醉植物：爪蟾—MS-222，小鼠—烏拉坦。解剖植物，取腦組織。切塊：依照不同的植物和組織選擇不同的方案。方案一：低熔點(diǎn)瓊脂包埋組織后進(jìn)行切塊。方案二：普通瓊脂作托進(jìn)行切塊。處理腦片：蔗糖氨水中40～60min（4°C或32°C）。孵育腦片：NaCl堿液中放置0.5~1h（溫度）后可進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。注：腦片制做過(guò)程需全程通入95%O2+5%CO2混和氣。二、全細(xì)胞膜片鉗記錄（一）盲法將腦片放在灌隔柵內(nèi)，用銀線壓牢，并確保灌流系統(tǒng)通暢、穩(wěn)定。右手接觸屏蔽罩以釋放操作者身體靜電。打開(kāi)放大器POWER→ON，記錄模式選擇檔。打開(kāi)-clamp軟件，點(diǎn)擊按鍵，檢測(cè)電壓及內(nèi)阻變化。系統(tǒng)選擇-50~-80mV。
安裝玻璃微電極。用注射器給電極內(nèi)施加適度正壓。增加電極入水，并接近腦片。封接：用微操縱器推進(jìn)電極接觸腦片，并逐步向腦片深處推動(dòng)，當(dāng)內(nèi)阻忽然減小，電壓增加1/3以上時(shí)，釋放注射器內(nèi)正壓，平緩抽吸，漸漸產(chǎn)生百兆歐姆封接（）。破膜：輕拉注射器，忽然出現(xiàn)大的電容電壓，表明已破膜，Whole-cell模式產(chǎn)生。迅速點(diǎn)擊按鍵，記錄模式選擇VC檔。點(diǎn)擊按鍵，可觀察電壓變化，而且不記錄、不保存。點(diǎn)擊按鍵，可觀察并保存電壓變化。（二）可視法基本步驟同盲法，不同的是須要在步驟8之前打開(kāi)監(jiān)視器的軟件，在水鏡頭下找到目的細(xì)胞后再將電極入水，漸漸接近腦片直到抵達(dá)該細(xì)胞，在可視的情況下完成后續(xù)步驟。單細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)流程()一、單細(xì)胞急性分離通常過(guò)程為：解剖→切片→孵育→消化→洗酶→吹打→細(xì)胞貼壁。以急性分離小鼠海馬神經(jīng)元為例表述如下：配制人工腦脊液(ACSF)250ml。解剖：斷頭取腦，在冰涼（0~4°C）ACSF中取出海馬。切塊：將海馬沿矢狀位劈成400~600μm厚的腦片。孵育：腦片在ACSF中溫度下孵育50min。消化：將孵育后的腦片移入酶消化液中，32°C消化25min。
洗酶：用ACSF洗腦片3次。吹打：依次用口徑遞減的三個(gè)吸管輕輕吹打腦片，制成單細(xì)胞懸液。貼壁：將單細(xì)胞懸液豎直靜置5min，汲取上方細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)皿中，約30min后細(xì)胞貼壁，即可進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。注：細(xì)胞急性分離過(guò)程需全程通入95%O2+5%CO2混和氣。二、全細(xì)胞膜片鉗記錄：?jiǎn)?strong>細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)須要在倒置顯微鏡下進(jìn)行，其步驟與腦片膜片鉗記錄過(guò)程基本相同。因?yàn)榭芍苯涌匆?jiàn)細(xì)胞，故可以將微電極直接接近并接觸目的細(xì)胞，完成封接、破膜等一系列過(guò)程。軟件設(shè)置和放大器操作不同之處主要有以下幾點(diǎn)：按下放大器POWER，記錄模式選擇Vm檔步入記錄軟件：開(kāi)機(jī)后按F8鍵步入MS-DOS系統(tǒng)→輸入“cd”命令→輸入“/”進(jìn)入記錄界面。File選擇預(yù)先設(shè)定好的剌激參數(shù)。Trial→監(jiān)測(cè)電壓變化，進(jìn)行封接和破膜，形成全細(xì)胞模式。記錄模式選擇檔Trial→View觀察電壓變化，而且不記錄、不保存。Trial→可觀察并保存電壓變化。拉制儀操作流程采用兩步法拉制玻璃微電極：打開(kāi)電源POWER(-)，預(yù)熱10min。調(diào)節(jié)拉制參數(shù)。第1
