關鍵詞：–Barrvirus；B；；viral；
作者及單位：四川醫科學院張曉副院長、廈門學院洪俊平博士、中山學院癌癥預防中心鐘玲博士等為論文共同第一作者。東莞學院癌癥預防中心徐淼院士、廈門學院夏寧邵院士、廈門學院陳毅歆院士等為論文共同通信作者。
文章亮點
靶點gB的兩株中和抗原3A3、3A5才能在體外及體內高效中和EBV感染；
3A3結合在gB中部的第II結構域細胞膜蛋白，3A5與gB腹部的第IV結構域結合，兩個表位均為新鑒別表位；
3A3及3A5辨識的表位是免疫優勢表位；
3A3及3A5通過不同的機制抑制膜融合過程。
實驗設計
首先用重組gB蛋白免疫美國大白兔細胞膜蛋白，借助B細胞單克隆分選技術篩選得到具有高結合能力和中學和能力的兩株兔源單克隆抗原3A3和3A5；隨即通過體內、體外模型驗證這兩株抗原的中和活性，借助Cryo-EM解析抗體-抗原復合物結構并鑒別抗原辨識表位；因而通過與EB病毒健康攜帶者及腫瘤病人的血漿進行競爭實驗，說明3A3及3A5辨識的表位在自然感染人群體內誘導抗原形成的優勢性；
最后通過膜融合試驗（如右圖所示）研究抗原抑制膜融合能力及其表位在膜融合過程中發揮的作用，并利用細胞結合實驗等生化方式進一步闡明3A3和3A5的中和機制。
主要實驗方式
01B細胞單克隆分選技術篩選抗原
用gB蛋白免疫美國大白兔后，采集約5毫升血液，分離、收集外周血單核細胞（PBMCs）。將PBMCs用PBS重懸，加入生物素標記的gB蛋白，在4℃下孵育30分鐘，PBS漂洗三次，800×g離心5分鐘。而后借助LIVE/DEADAqua，mouseanti-CD4:FITC，mouseanti-CD8:FITC，mouseanti-T:FITC，mouseanti-IgM:RPE以及APC進行染色，而后使用BDFACSAriaIII細胞分選儀進行B細胞分選。將抗體陰性的B細胞分選到96孔板中，體外培養7天，搜集上清進行ELISA檢查。最后，提取陰性B細胞的RNA，反轉錄cDNA，采用巢式PCR釣取抗體重鏈和輕鏈可變區，將PCR產物插入富含兔重鏈或輕鏈恒定區的載體中，借助293F細胞抒發重組抗原。
02膜融合試驗
抗原抑制膜融合能力鑒別
效應細胞：HEK-293T達到80%匯合度時，轉染2.5μg-gB、-gH、-gL和-T7（抒發T7DNA聚合酶）。受體細胞：HEK-293T細胞轉染10μg（在T7啟動子控制下抒發螢光素酶報告基因）。轉染24小時后，將2×105效應細胞消化，加入20μg3A3、3A5、3A3+3A5和1E12在37℃下孵育30分鐘。之后，將該抗原-效應細胞混和物與2×105受體細胞在24孔板中混和共培養24小時。根據Dual-Glo?assay()的說明，裂解共培養的細胞，定量螢光素酶活性。
抗原辨識的表位在膜融合中的作用探究
效應細胞：HEK-293T達到80%匯合度時，轉染2.5μg-gB突變體、-gH、-gL和-T7（抒發T7DNA聚合酶）。受體細胞：HEK-293T細胞轉染10μg（在T7啟動子控制下抒發螢光素酶報告基因）。轉染24小時后，將2×105效應細胞與2×105受體細胞在24孔板中混和共培養24小時。根據Dual-Glo?assay()的說明，裂解共培養的細胞，定量螢光素酶活性。
主要實驗試劑
主要結果展示
013A3、3A5在體外可以中和EBV感染并明顯抑制膜融合
兩株抗原均可有效中和上皮和B細胞感染，再者也就能有效抑制膜融合過程。另外，在細胞感染阻斷模型中聯合使用3A3和3A5顯示出較強的協同效應。
023A3及3A5通過不同的機制抑制EBV感染
在細胞膜融合模型中，3A3關熱鍵點突變蛋白不影響gB的膜融合功能，而3A5的關熱鍵點突變均可抑制gB的膜融合功能，說明3A5所辨識的表位對于gB在膜融合過程當中的變構至關重要，3A5可能通過制約gB變構而發揮中和功能。而3A3的表位與gB輔助受體NRP1的結合表位重疊，3A3所辨識關熱鍵點突變后，gB不能與NRP1結合，說明3A3可能通過阻斷gB與受體的結合而發揮中和療效。
參考建議
1、雙螢光素酶報告基因受多種誘因影響，非常是要保證細胞狀態和轉染效率等；
2、孔與孔之間讀值差異較大，建議實驗通常須要做3個或3個以上復孔；
3、裂解過程盡量在冰浴中進行；
4、樣品發光值應當遠小于背景值，通常起碼在10萬的讀值以上。
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