關(guān)鍵詞：–Barrvirus；B；；viral；
作者及單位：四川醫(yī)科學(xué)院張曉副院長、廈門學(xué)院洪俊平博士、中山學(xué)院癌癥預(yù)防中心鐘玲博士等為論文共同第一作者。東莞學(xué)院癌癥預(yù)防中心徐淼院士、廈門學(xué)院夏寧邵院士、廈門學(xué)院陳毅歆院士等為論文共同通信作者。
文章亮點(diǎn)
靶點(diǎn)gB的兩株中和抗原3A3、3A5才能在體外及體內(nèi)高效中和EBV感染；
3A3結(jié)合在gB中部的第II結(jié)構(gòu)域細(xì)胞膜蛋白，3A5與gB腹部的第IV結(jié)構(gòu)域結(jié)合，兩個(gè)表位均為新鑒別表位；
3A3及3A5辨識(shí)的表位是免疫優(yōu)勢表位；
3A3及3A5通過不同的機(jī)制抑制膜融合過程。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
首先用重組gB蛋白免疫美國大白兔細(xì)胞膜蛋白，借助B細(xì)胞單克隆分選技術(shù)篩選得到具有高結(jié)合能力和中學(xué)和能力的兩株兔源單克隆抗原3A3和3A5；隨即通過體內(nèi)、體外模型驗(yàn)證這兩株抗原的中和活性，借助Cryo-EM解析抗體-抗原復(fù)合物結(jié)構(gòu)并鑒別抗原辨識(shí)表位；因而通過與EB病毒健康攜帶者及腫瘤病人的血漿進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)，說明3A3及3A5辨識(shí)的表位在自然感染人群體內(nèi)誘導(dǎo)抗原形成的優(yōu)勢性；
最后通過膜融合試驗(yàn)（如右圖所示）研究抗原抑制膜融合能力及其表位在膜融合過程中發(fā)揮的作用，并利用細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)等生化方式進(jìn)一步闡明3A3和3A5的中和機(jī)制。
主要實(shí)驗(yàn)方式
01B細(xì)胞單克隆分選技術(shù)篩選抗原
用gB蛋白免疫美國大白兔后，采集約5毫升血液，分離、收集外周血單核細(xì)胞（PBMCs）。將PBMCs用PBS重懸，加入生物素標(biāo)記的gB蛋白，在4℃下孵育30分鐘，PBS漂洗三次，800×g離心5分鐘。而后借助LIVE/DEADAqua，mouseanti-CD4:FITC，mouseanti-CD8:FITC，mouseanti-T:FITC，mouseanti-IgM:RPE以及APC進(jìn)行染色，而后使用BDFACSAriaIII細(xì)胞分選儀進(jìn)行B細(xì)胞分選。將抗體陰性的B細(xì)胞分選到96孔板中，體外培養(yǎng)7天，搜集上清進(jìn)行ELISA檢查。最后，提取陰性B細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用巢式PCR釣取抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)，將PCR產(chǎn)物插入富含兔重鏈或輕鏈恒定區(qū)的載體中，借助293F細(xì)胞抒發(fā)重組抗原。
02膜融合試驗(yàn)
抗原抑制膜融合能力鑒別
效應(yīng)細(xì)胞：HEK-293T達(dá)到80%匯合度時(shí)，轉(zhuǎn)染2.5μg-gB、-gH、-gL和-T7（抒發(fā)T7DNA聚合酶）。受體細(xì)胞：HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染10μg（在T7啟動(dòng)子控制下抒發(fā)螢光素酶報(bào)告基因）。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將2×105效應(yīng)細(xì)胞消化，加入20μg3A3、3A5、3A3+3A5和1E12在37℃下孵育30分鐘。之后，將該抗原-效應(yīng)細(xì)胞混和物與2×105受體細(xì)胞在24孔板中混和共培養(yǎng)24小時(shí)。根據(jù)Dual-Glo?assay()的說明，裂解共培養(yǎng)的細(xì)胞，定量螢光素酶活性。
抗原辨識(shí)的表位在膜融合中的作用探究
效應(yīng)細(xì)胞：HEK-293T達(dá)到80%匯合度時(shí)，轉(zhuǎn)染2.5μg-gB突變體、-gH、-gL和-T7（抒發(fā)T7DNA聚合酶）。受體細(xì)胞：HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染10μg（在T7啟動(dòng)子控制下抒發(fā)螢光素酶報(bào)告基因）。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將2×105效應(yīng)細(xì)胞與2×105受體細(xì)胞在24孔板中混和共培養(yǎng)24小時(shí)。根據(jù)Dual-Glo?assay()的說明，裂解共培養(yǎng)的細(xì)胞，定量螢光素酶活性。
主要實(shí)驗(yàn)試劑
主要結(jié)果展示
013A3、3A5在體外可以中和EBV感染并明顯抑制膜融合
兩株抗原均可有效中和上皮和B細(xì)胞感染，再者也就能有效抑制膜融合過程。另外，在細(xì)胞感染阻斷模型中聯(lián)合使用3A3和3A5顯示出較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。
023A3及3A5通過不同的機(jī)制抑制EBV感染
在細(xì)胞膜融合模型中，3A3關(guān)熱鍵點(diǎn)突變蛋白不影響gB的膜融合功能，而3A5的關(guān)熱鍵點(diǎn)突變均可抑制gB的膜融合功能，說明3A5所辨識(shí)的表位對于gB在膜融合過程當(dāng)中的變構(gòu)至關(guān)重要，3A5可能通過制約gB變構(gòu)而發(fā)揮中和功能。而3A3的表位與gB輔助受體NRP1的結(jié)合表位重疊，3A3所辨識(shí)關(guān)熱鍵點(diǎn)突變后，gB不能與NRP1結(jié)合，說明3A3可能通過阻斷gB與受體的結(jié)合而發(fā)揮中和療效。
參考建議
1、雙螢光素酶報(bào)告基因受多種誘因影響，非常是要保證細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率等；
2、孔與孔之間讀值差異較大，建議實(shí)驗(yàn)通常須要做3個(gè)或3個(gè)以上復(fù)孔；
3、裂解過程盡量在冰浴中進(jìn)行；
4、樣品發(fā)光值應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)小于背景值，通常起碼在10萬的讀值以上。
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