摘要：
背景和目的近些年來一些病例報告顯示:患有根尖周炎或根尖囊腫的年青牙齒,經診治后牙齒尖持續發育成型。傳統觀點覺得:根尖周炎伴發膿腫及根尖透射影像,骨膜活力測試陽性時牙冠已全部壞死,牙齒將停止發育,其實,傳統知識難于解釋此現象。學者推斷根管內及附近組織中一定還存在能促進牙齒繼續發育成型的誘因。由此提出"血管重建"假說,并覺得:年青牙齒厚實的根尖提供了從根皺襞到根尖周組織的良好通路,當僅有部份牙冠感染時,可能引起根尖周癌癥;但是因為通暢的血液循環,骨膜和根尖乳房中的干細胞似乎仍存活于有感染的組織中,并可發生牙周再生及根尖成型。2006年,[8]從阻生臼齒的根尖乳房中分離得到具有高度增殖能力和多向分化潛能的干細胞,將其命名為根尖乳房干細胞(stemcellsfrom,SCAP)。研究表明,與牙周干細胞相比(pulpstemcells,DPSCs),SCAP表現出更高的溴脫氧尿苷吸焦比,數目倍增能力,更強的細胞遷移能力以及更多的細胞陰性抒發STRO-1(間充質干細胞表面標志)。SCAP經成骨,成脂和神經方向誘導后,具有向成骨細胞,脂肪細胞和神經細胞分化的能力。
體外擴增的SCAP以甲基磷灰石/乙酸三鈣(/,HA/TCP)為載體,在免疫缺陷大鼠體內能產生骨膜牙本質樣復合體。Huang以聚乙丙交酯(poly-D,L-and,PLG)為載體,將SCAP接種于載體上,借助根管片斷模型進行骨膜再生的實驗,結果顯示除了有含血管的牙冠樣組織生成,更重要的是,原有牙本質和MTA表面有一層連續均勻的牙本質樣組織生成。表明人SCAP分化為成牙本質樣細胞后,從而產生牙本質。患有根尖周炎或根尖囊腫的年青牙齒中存活的SCAP可能具有促進腫瘤根尖周組織繼續發育成型的作用。喂奶植物的牙齒發育是一個常年的過程,包括牙齒發育啟動,牙齒延長并完善鼻竇附著關系,臼齒萌出直到咬合關系構建,最后牙齒發育完成,根尖孔閉合。在這一過程中,牙齒進一步發育同時伴有牙髓組織產生及鼻竇附著的完善,進而使牙齒及牙髓組織產生一個功能單位被錨定在頜骨上。牙齒及牙髓組織共同的發育依賴于發育期牙齒的根端組織持續增殖并分化。在結構上,發育期牙齒的根端組織包含單層上皮細胞構成的鞘樣結構,即上皮根鞘('sroot,HERS),上皮根鞘將其下方的外胚間充質組織界定為牙乳房及牙囊。
往年的研究表明牙囊可分化產生鼻竇膜,牙骨質和牙槽骨等牙髓組織,而牙乳房產生牙本質及牙周,上皮根鞘則作為牙齒產生的誘導者和調節者,調節牙齒大小細胞膜片,形狀和牙齒數。學者發覺調節牙齒及鼻竇組織發育的訊號分子,如BMP,同源異形盒基因家族Msx和Shh,FGF,GDF均定位于發育期的根端組織。猜想可能通過細胞-細胞及細胞-基質間的互相作用并由此形成的訊號分子使牙齒和鼻竇組織產生細胞的前體細胞分化,因而促使牙齒和鼻竇組織的形態發生。臼齒萌出前,牙囊包圍著成釉器與牙乳房組織。但是在牙根萌出后,牙囊僅穩居發育期牙齒根端,與牙乳房相連,兩種組織間喪失了牙胚發育初期所存在的組織學分界。考慮到牙齒,牙髓組織在發育上的同步性以及兩者功能上的完整性,學者將發育期的牙齒根端組織命名為"根端發育復合體"(,DAC)。學者將SD小鼠DAC與陶瓷化骨混和后,移植到小鼠腎包膜下細胞膜片,4W后可見牙本質,牙骨質,鼻竇膜及骨樣組織產生。由此推斷DAC在牙齒發育時期,除了繼續產生牙齒,同時也產生牙髓組織,以完善結構完整的牙齒/鼻竇復合體,因而行使吞咽功能。學者借助大型豬植物模型,眼科放療清除牙齒發育早期的牙乳房后,雖然骨膜組織完整,但牙齒停止發育;相比之下,富含牙乳房的其它牙齒生長和發育均正常。
由此推斷牙乳房在牙齒發育中起著重要作用。牙乳房作為"根端發育復合體"的一部份,其單獨作用,是否也能產生牙髓組織呢?本課題從人未發育完全的年青牙齒中分離培養SCAP和鼻竇膜干細胞(stemcells,),并分別測定其克隆產生率,細胞增殖能力,并于體外誘導培養條件下,觀察其礦化和向脂肪細胞分化的能力,以及測定其在體外是否抒發鼻竇膜相關標志,觀察SCAP在體外是否表現鼻竇特點。致力探求來自發育中組織的SCAP,是否與根尖區牙髓組織的產生有密切聯系,為牙齒及牙髓組織共同發育機制提供一定的根據。方式1,SCAP與的搜集和培養選定16-20歲健康病人牙齒未發育完全(牙齒發育2/3)的阻生臼齒,根據等的實驗方式,采用組織貼塊法培養細胞。將從同一顆牙切取的牙乳房組織和鼻竇膜組織充分剪碎后接種于細胞培養瓶內培養。2,免疫螢光測量干細胞表面標志STRO-1分別取第1代的兩種干細胞,用免疫螢光法測量兩種干細胞是否抒發干細胞表面標志STRO-1。3,SCAP與(?)細胞克隆產生實驗在6孔板中按200個細胞/孔的密度分別接種第1代的兩種干細胞,連續培養10d后,結晶紫染色觀察細胞克隆數。
4,SCAP與生長曲線的測定分別取第2代SCAP和的單細胞懸液,MTT法測各孔OD值,連續測8天,以時間為縱軸,每晚的平均OD值為橫軸勾畫生長曲線。5,SCAP與的礦化能力取第3代兩類干細胞,在礦化誘導液中分別誘導7d,14d和21d后,茜素紅染色觀察礦化團塊產生情況,免疫螢光染色法測量礦化相關標志物ALP,BSP和OC的抒發情況,以及螢光定量PCR測量這三種標志物在兩種干細胞中的抒發差別。兩類干細胞在普通培養基中培養60d后,茜素紅染色觀察鈣囊腫產生情況以及螢光定量PCR測量礦化相關標志物在兩種干細胞中的抒發差別。6,SCAP與的成脂誘導分化取第3代兩類干細胞,在成脂誘導液中分別誘導21d后,油紅O染色觀察脂滴產生情況。7,SCAP與細胞膜片的制備取第3代兩類干細胞,在含維生素C的誘導液中誘導14d后,光鏡下觀察細胞外基質產生情況。剝離細胞膜片,制成石蠟切塊,HE染色觀察細胞膜片形態。8,RT-PCR檢查SCAP與的鼻竇膜標志物分別取兩類干細胞的第3,5,7,9代,RT-PCR檢查鼻竇膜標志物和。
9,經礦化誘導后的變化螢光定量PCR檢查SCAP與在礦化誘導培養基中培養21d后,與誘導前的變化。10,統計學處理采用。0統計軟件數據進行兩個樣本t檢驗,結果以均數±標準差(X±S)表示,p0。05表示差別有明顯意義。結果1,細胞形態及生長情況細胞約5-7d從組織塊周圍爬出,兩種細胞形態相像,均呈短梭,多角形。傳代后細胞呈成纖維細胞形態,細胞大小和形態趨近一致。2,免疫螢光檢查干細胞表面標志STRO-1第1代SCAP和均陰性抒發STRO-1。3,SCAP與細胞克隆產生實驗SCAP和均能產生克隆細胞團,SCAP產生的克隆數低于4,SCAP與生長曲線的測定兩種干細胞在第3天步入對數生長期,SCAP的增殖活力顯著強于。5SCAP與的礦化能力兩種干細胞經成骨誘導后,細胞復層生長,集聚成簇,茜素紅染色均可見鈣囊腫產生,隨著誘導時間降低,鈣囊腫逐步增多。免疫螢光顯示兩種干細胞均陰性抒發礦化相關標志物ALP,BSP和OC,螢光定量PCR顯示這三種標志物在SCAP中的抒發均低于。
細胞在普通培養基中培養60d后,茜素紅染色均陰性,且SCAP中ALP,BSP和OC的基因抒發均低于。6,SCAP與的成脂誘導分化SCAP和在成脂誘導體系的作用下,21d左右可見細胞中出現串珠樣透明高色溫點,并有部份融合,油紅-O染色呈陰性。7,SCAP與細胞膜片的產生SCAP和經誘導14d后,大量細胞外基質產生,成熟膜片產生,組織學檢測顯示兩種膜片較為均勻,細胞間含有大量的細胞外基質。8,RT-PCR檢查:SCAP與的鼻竇膜標志物RT-PCR顯示第3,5,7,9代的兩種干細胞均抒發鼻竇膜標志物和。9,經礦化誘導后的變化經礦化誘導后,在SCAP和抒發均升高。推論本實驗成功分離培養SCAP與,兩種細胞具有干細胞特點,抒發干細胞表面標志物,且具有礦化,成脂分化的能力。SCAP的克隆產生能力,細胞增殖能力和礦化能力均低于。與一樣,SCAP也抒發鼻竇膜相關標志物,否認SCAP在體外表現鼻竇特點。SCAP也許可作為組織工程鼻竇再生的干細胞來源。
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