膽固醇是人體固醇代謝的產物，在體內過度積累會引起高膽固醇血癥。而甘油三酯鹽晶體在關節、腎臟等組織中過度沉積能誘發癲癇[1]和慢性心臟病癥[2]等。流行病學研究顯示喝酒、吸煙、肥胖、糖尿病、高血脂和血壓異常等是誘發高膽固醇血癥的主要危險誘因[3-4]。據統計，2018—2019年中國成年人的高膽固醇血癥得病率為14.0%，相比2015—2016年患癌率明顯下降。目前臨床常用的降血膽固醇抗生素，包括黃固醇氧化酶抑制劑、促血糖排尿抗生素和重組血糖酶劑型等，都存在著一定的局限性，如別嘌醇可能誘發超敏反應，非布司他具有潛在的心血管風險，苯溴馬隆具有損傷轉氨酶能、酸化精液、減少膽固醇代謝和排尿的不良反應[5]，這使得研究者進一步研制高效廣譜的抗高血脂抗生素。
高血糖血癥的主要誘因是固醇代謝衰弱而導致的膽固醇形成過多或排尿失衡。研究發覺，胰臟中的黃固醇氧化還原酶（，XOR）是參與固醇分解代謝的關鍵酶，XOR由黃固醇酯化酶（，XDH）和黃固醇氧化酶（，XOD）組成，前者在血糖的生成過程發揮著重要作用[6-7]。據悉，XOD還可通過形成超氧化物和二溴化氫推動體內活性氧（，ROS）的形成。另有研究表明，膽固醇一旦步入細胞，都會成為一種促氧化劑細胞膜水通道，降低ROS的過度生成[8-9]。
線粒體與機體的氧化還原穩態密切相關。損壞的線粒體能引起機體ROS的過度積累[10-11]。反過來，ROS積聚也可能造成線粒體功能損傷[12]。研究表明，線粒體融合與分裂活動由諸多線粒體功能蛋白參與完成，其動態平衡是線粒體維持有效功能的關鍵[13]。二溴化物酶體增殖物活化受體γ輔助活化因子-1（-gamma-1，PGC-1）家族參與線粒體產生和能量代謝，且在調控其他細胞功能方面也發揮著核心作用[14]。PGC-1α在氧化應激中推動抗氧化酶的轉錄，并參與調控脂肪酸氧化、三乙酸循環、氧化應激反應、線粒體生物發生和動力學等相關基因的抒發[15]。另有研究發覺，高膽固醇血癥可造成小鼠肝臟線粒體功能障礙，其病理機制與腎皮質氧化應激損傷相關[16]。
四妙散首載于清代醫家張秉持所著的《成便捷讀》，由黃柏、蒼術、牛膝、薏苡仁4味草藥組成，以黃柏為君藥，其主要功效為祛風利濕，臨床常應用于燥熱下注所致筋絡腫脹、下肢痿軟無力、足膝腫脹酸痛等癥。研究表明，四妙散具有醫治哮喘和腦病綜合征等的功效[17]，這些作用可能與調節抗氧化酶的活性有關[18]。并且，四妙散能夠通過調節胰腺組織線粒體的生物活性，提高機體抵抗氧化應激的能力，從而改善血膽固醇的代謝和腎功能，尚未見相關報導。為此，本研究以氧嗪碘化鉀和次黃固醇聯合誘發的高血糖血癥大鼠為模型，闡述四妙散減少血膽固醇的作用以及對心臟線粒體相關蛋白的影響，以期為預防高膽固醇血癥及其并發癥的抗生素研究提供新的策略。
1材料
1.1植物
48只SPF級雌性廣州種家兔，體質量（20±2）g，由斯貝福（上海）生物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。所有家兔均以正常草料適應性喂養1周。實驗方案經上海中醫藥學院植物實驗倫理委員會批準（批準號BUCM-4-202）。
1.2草藥
四妙散由黃柏、蒼術、牛膝和薏苡仁組成，以上草藥購自上海同壽堂股份有限公司，經上海中醫藥學院王學勇院士鑒別為蕓香科動物白皮樹.的干燥樹根、菊科動物北柴胡(DC.)Koidz.的干燥塊莖、莧科動物當歸Bl.的干燥根、禾專科動物薏苡Coix-jobiL.var.(Roman.)Stapf的干燥成熟蒴果。
1.3藥品與試劑
對照品硫酸小檗堿（批號633-65-8，質量分數＞98%）、β-脫皮激素（批號5289-74-7，質量分數＞98%）購自上海瑞芬思生物科技有限公司；氧嗪碘化鉀（批號）、次黃固醇（批號）購自北京麥克林生化科技有限公司；別嘌醇（批號）購自北京信誼萬象制藥股份有限公司；血糖測試盒（批號C12-2-1）、XOD測試盒（批號A002-1-1）、微量還原型蘆?。?，GSH）測定試劑盒（批號A006-2-1）、氧化型蘆?。?，GSSG）測試盒（批號A061-1-2）、丙二醛（，MDA）測試盒（批號A003-1）、超氧化物歧化酶（，SOD）測定試劑盒（批號A001-3-2）購自上海建成生物工程研究所；線粒體融合蛋白1（1，MFN1）抗原（批號66776-1-Ig）、MFN2抗原（批號12186-1-AP）、視神經萎縮相關蛋白1（optic1，OPA1）抗原（批號27733-1-AP）、線粒體動力相關蛋白1（-，DRP1）抗原（批號12957-1-AP）、PGC-1α抗原（批號66369-1-Ig）、β-actin抗原（批號66009-1-Ig）、HRP標記的綿羊抗兔IgG二抗（批號-2）、HRP標記的綿羊抗鼠IgG二抗（批號-1）購自公司。
1.4儀器
型電子天平（美國公司）；FLUOstarOmega多功能酶標儀（日本BMG公司）；22331離心機（美國公司）；電泳和轉膜裝置（日本Bio-Rad公司）；型全手動物理發光/螢光圖象剖析系統（北京天能公司）；HPLC/Q-TOF-MS剖析儀（英國公司）；BX53型倒置顯微鏡（美國公司）。
2方式
2.1四妙檐口提液的制備及主要成份濃度測定
將適量四妙散（黃柏15g、蒼術15g、牛膝10g、薏苡仁30g，總生用量為70g）先加入10倍容積的去離子水，泡制2h后倒出，再加入8倍容積的去離子水，泡制2h后倒出，合并水煎液，濾去藥渣，濃縮至所需的含量。依據臨床成人生用量和體表面積法，四妙散中劑量組大鼠給用量為9.1g/kg，低、高劑量組大鼠給用量分別為4.55、18.2g/kg。
四妙勒腳提液稀釋100倍得進樣樣品，對照品精準稱定并溶于乙醇，配得30μg/mL硫酸小檗堿和1mg/mLβ-脫皮激素，之后將樣本和對照品通過0.22mm膜濾過，再進行HPLC/Q-TOF-MS剖析。色譜條件：C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相為苯酚（A）-0.1%乙酸水氨水（B），梯度洗脫：0～50min，95%～10%B；50～50.1min，10%～95%B；50.1～55min，95%B；柱溫35℃；容積流量0.3mL/min；進樣量10μL。質譜條件：正、負離子模式；質量范圍m/z100～1500；離子源噴霧電流3.5kV；碰撞能量35eV；毛細管氣溫320℃；探頭加熱氣溫400℃。結果用進行剖析。
2.2高膽固醇血癥大鼠分組、造模及給藥
大鼠適應性喂養1周后，隨機分成對照組、模型組、別嘌醇（5mg/kg）組和四妙散低、中、高劑量（4.55、9.1、18.2g/kg）組，每組8只。按照Zhang等[19]造模方式復制高血糖大鼠模型，除對照組外，其余大鼠分別用氧嗪碘化鉀（300mg/kg，0.9%生理鹽水配制，ip）和次黃固醇（500mg/kg，0.5%羧丙基纖維素鈉配制細胞膜水通道，ig）造模。對照組大鼠分別ig等容積0.5%羧丙基纖維素鈉和ip等容積生理鹽水，1次/d。每次造模1h后ig給藥，對照組和模型組ig等容積去離子水，連續7d。第6天給藥后，將幼鼠放置代謝籠中搜集汗液。第7天給藥1h后分別取血、肝臟和胰臟，其中一部份腎臟和肝臟放在?80℃凍存，另一部份放在4%多聚甲醛固定。
2.3血漿生化指標測定
根據試劑盒說明書測定血漿和精液中膽固醇濃度，測定血漿中GSH、GSSG、MDA濃度及SOD活力，肝組織XOD活力以及腎組織GSH濃度。
2.4蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理變化
將固定在4%多聚甲醛濾液中的心臟組織根據常規HE染色法進行脫水、包埋、切片和染色，中性樹膠封片后放在倒置顯微鏡下觀察心臟組織病理變化并照相。
2.測量腎組織MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和PGC-1α蛋白抒發的影響
將適量的心臟組織用RIPA裂解液裂解，之后采用高溫機械勻漿的方式提取組織蛋白，BCA法測定蛋白含量。將變性蛋白樣品經10%十二羰基氯化鈉-聚丙烯丙酯凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后，分別加入MFN1（1∶4000）、MFN2（1∶4000）、OPA1（1∶2000）、DRP1（1∶1000）和PGC-1α（1∶4000）抗原，4℃孵育過夜。隔日，加入二抗（1∶4000），溫度孵育1h后，用ECL超敏發光液顯色，Azure凝膠成像儀照相。以相應的β-actin作為內參，借助ImageJ圖象剖析軟件對各目標條帶的灰度值進行半定量剖析。
2.6統計學剖析
借助prism8.0軟件對數據進行統計剖析，用表示。數據滿足正態分布且殘差齊時采用單誘因殘差剖析（ANOVA）；殘差不齊時使用近似F檢驗。數據不滿足正態分布時，則使用非參數檢驗。
3結果
3.1四妙檐口提液的主要物理成份剖析
借助UPLC/MS技術測定四妙散中的硫酸小檗堿和β-脫皮激素的濃度。通過面積歸一化法[20]以對照品和樣品中硫酸小檗堿與β-脫皮激素的色譜圖（圖1）峰面積估算得，硫酸小檗堿在四妙散中的質量分數為7.6mg/g，占黃柏生藥濃度的3.54%；β-脫皮激素在四妙散中的質量分數為1.9mg/g，占當歸生藥濃度的1.36%?！吨袊幍洹?020年版規定[21]，小檗堿在黃柏中質量分數不高于3%，β-脫皮激素在澤蘭中質量分數不高于0.03%，本研究四妙散中硫酸小檗堿與β-脫皮激素的濃度符合《中國藥典》2020年版規定。
3.2四妙散對高膽固醇血癥大鼠血漿和精液中膽固醇濃度的影響
如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中膽紅素水平明顯下降（P＜0.001），精液中膽紅素水平明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組血漿中膽紅素水平明顯減少（P＜0.001），精液中膽固醇水平明顯下降（P＜0.05、0.01、0.001）。由實驗結果可知，各劑量的四妙散均顯著降低血液中膽固醇濃度，促使血糖隨精液排出體外。但是，不同劑量的四妙散增加血漿膽固醇的療效無顯著差別，低、中劑量的四妙散推動血糖隨精液的排尿的作用顯著低于高劑量的四妙散（P＜0.05）。以上結果提示，四妙散能減少高血糖血癥大鼠血液中的膽固醇水平，同時推動膽固醇經肝臟的排尿。
3.3四妙散對高膽固醇血癥大鼠血漿中GSH、GSSG、SOD、MDA濃度的影響
如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠血漿中GSH水平和SOD活力明顯減少（P＜0.05），GSSG和MDA水平明顯下降（P＜0.05、0.001）；與模型組比較，各給藥組血漿中GSH水平和SOD活力明顯下降（P＜0.05、0.01、0.001），GSSG和MDA水平明顯升減少（P＜0.05、0.001）。以上結果表明，四妙散才能促使高血糖血癥大鼠的還原氧化平衡，進而改善大鼠機體的氧化應激狀態。
3.4四妙散對高血糖血癥大鼠腸道XOD的影響
如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠肝勻漿中XOD活力明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組肝勻漿中XOD活力明顯減少（P＜0.05）。表明四妙散干預能減少高血糖血癥大鼠腸道中XOD的活性，抑制膽固醇的生成。
3.5四妙散對高血糖血癥大鼠肝臟組織病理變化的影響
如圖5所示，對照組大鼠的腎小球、間質和腎小管形態正常，細胞排列緊密。模型組大鼠腎組織內腎小球萎縮，腎小管擴張且擴張腔內可見腎小管上皮開裂，管型，腎小管空泡化，結構不清。與模型組比較，四妙散組大鼠腎組織損傷程度顯著減緩，腎小管擴張和腎小球萎縮顯著改善。以上結果表明四妙散對高血糖誘發的心臟損傷具有保護作用。
3.6四妙散對高膽固醇血癥大鼠肝臟中GSH濃度的影響
如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中GSH水平明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組心臟中GSH水平明顯下降（P＜0.05、0.01），這表明四妙散能提升高膽固醇血癥大鼠腎組織的抗氧化能力。
3.7四妙散對高膽固醇血癥大鼠肝臟組織MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和PGC-1α蛋白抒發的影響
因為四妙散低劑量在改善血糖代謝方面，與中、高劑量具有類似或則較好的療效，所以本實驗僅研究四妙散低劑量改善腎損傷的可能作用機制。既往研究提示，MFN1、MFN2調控線粒體外膜的融合，OPA1調控線粒體內膜的融合，DRP1調控線粒體的分裂，PGC-1α調控線粒體的能量代謝、參與線粒體結構產生[22-23]。如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠肝臟中MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒發水平均明顯減少（P＜0.05），DRP1蛋白抒發水平明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，四妙散低劑量組心臟中MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒發水平顯著下降（P＜0.05），DRP1蛋白抒發水平明顯減少（P＜0.05）。這表明四妙散可明顯改善高血糖血癥大鼠肝臟的線粒體功能。
4討論
本研究采用氧嗪碘化鉀和次黃固醇聯合給藥法構建急性高血糖血癥大鼠模型，結果發覺高血糖血癥大鼠血漿膽固醇水平明顯下降，精液血糖水平明顯增加，胰臟XOD活性提高，血漿GSH水平及SOD活力明顯增加，GSSG、MDA水平明顯下降；心臟組織出現腎小管擴張、上皮開裂及腎小球萎縮等一系列病理變化，心臟GSH濃度明顯增加，且線粒體MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒發均明顯增加，DRP1蛋白抒發明顯下降。而四妙女兒墻提液能通過逆轉上述指標的變化，改善高血糖血癥大鼠的膽固醇代謝和腎組織損傷。
本研究發覺，高膽固醇血癥大鼠血漿膽紅素水平較空白組明顯下降，而四妙散干預后能顯著減低高膽固醇血癥大鼠血漿膽固醇水平，這一結果與文獻報導一致[24]。既往研究表明，機體內XOD可將次黃固醇氧化為黃固醇，并在將前者氧化為膽固醇的過程中形成2個超氧自由基，而細胞外的超氧化物才能歧化為巰基化氫，細胞外超氧自由基和二溴化氫分別通過氯通道3和水通道穿透細胞膜，隨即啟動細胞內訊號和氧化應激[25-26]。蘆丁是細胞重要的抗氧化緩沖劑，主要以GSH和GSSG的方式存在，蘆丁氧化與還原酶催化三者的相互轉化，以維持細胞內蘆丁的穩態和氧化還原平衡[27]。SOD和MDA也是測量氧化應激的標志物，后者消除對機體有害的超氧陰離子自由基，前者為自由基作用于脂類發生二溴化反應的終產物。本實驗結果顯示，四妙散才能下降高膽固醇血癥大鼠血漿或腎組織中GSH水平及SOD活力，增加GSSG和MDA水平，這說明四妙散改善高膽固醇血癥家兔體內膽固醇代謝的作用可能與推動氧化還原平衡有關。據悉，低、中、高劑量的四妙散降血膽固醇、抗氧化及抑制膽固醇產生作用無顯著差別，低、中劑量的四妙散促血糖排尿作用顯著優于高劑量，減輕肝損傷作用與劑量呈相反趨勢。
本研究和其他實驗室研究均表明[28]，四妙散能促使血糖的排尿，進而改善血糖代謝，且具有腎保護作用。心臟線粒體動力學與其功能有著密切聯系，線粒體動力學是指活細胞中的線粒體持續不斷地互相融合聯接產生網路狀結構或分裂產生彼此分散存在的個體動態變化。線粒體融合是相鄰線粒體先后融合外膜和內膜的過程，是修補破損線粒體的重要手段，參與該過程的膜蛋白主要是外膜MFN1/2和內膜OPA1[29]。線粒體分裂形式分為中區分裂和外周分裂，中區分裂主要與DRP1有關[30]。研究表明，MFN2缺少會造成兩個細胞器形成化學間隙，因而改變核糖形態并破壞這種細胞器之間的鈣轉移[31]，從而影響線粒體結構與功能的完整性。另有研究表明，OPA1能維持緊密的嵴聯接因而提升呼吸效率并支持呼吸鏈超復合物組裝[32]，且能減少臟器對自噬和氧化損傷的易感性[33]，因而維持體內氧化還原平衡，減少氧化應激對臟器的損害。據悉，膽固醇能明顯下調小鼠腎細胞中DRP1蛋白抒發水平[34]。DRP1也參與二溴化物酶體分裂[29]。線粒體融合與分裂活動處于動態平衡中，當膜融合蛋白與分裂蛋白抒發異常時，線粒體的自我修補能力減慢，其生物活性可能遭到影響。本研究也發覺高膽固醇血癥大鼠肝臟組織中線粒體MFN1、MFN2、OPA1、PGC-1α蛋白抒發明顯降低，DRP1蛋白抒發明顯降低，這說明線粒體的自我更新能力減緩和生物活性破損。四妙散可通過推動肺臟線粒體蛋白的抒發，而發揮促使血糖排尿和保護心臟的作用。
本研究發覺，四妙散能改善高血脂癥大鼠的氧化還原平衡。其他團隊研究也發覺，四妙散的主要草藥黃柏的水提取物和醇提取物可消除次黃固醇-黃固醇氧化酶系統形成的超氧陰離子和反應生成的氧自由基[35]，黃柏的主要成份小檗堿能降低二溴化氫誘導的巨噬細胞線粒體ROS的生成[36]。據悉，小檗堿和黃柏酮還能調節線粒體的融合與分裂[37-38]。當歸香豆素II才能提升骨關節炎小鼠血漿中SOD活力和GSH水平，減低MDA水平，進而調節氧化應激[39]。當歸的重要成份脫皮甾酮可能通過降低氧化應激的產物，提高抗氧化酶的功能，調節線粒體的功能，進而保護H9c2細胞[40]。薏苡仁富含豐富的花青素類化合物，并被證明其總抗氧化能力與之有明顯相關性[41]。這說明四妙散可能通過調節線粒體相關蛋白的抒發以維持線粒體的功能，改善機體抗氧化應激的能力，進而改善高膽固醇血癥及其誘發的腎損傷。
綜上，本研究表明四妙散能改善高膽固醇血癥大鼠的膽固醇代謝，抑制肝臟損傷，其作用機制可能與抑制XOD活性，以及調節線粒體融合和分裂，從而提高機體抗氧化應激能力有關。本研究為四妙散醫治高膽固醇血癥的臨床應用提供了一定的科學根據，同時也為其他降血膽固醇抗生素的機制研究提供了策略。
利益沖突所有作者均申明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來源：王釤，張悅怡，劉田園，盧美希，戴璇，劉亞鴿，張艷菲，王麗麗，張東偉．四妙散改善高膽固醇血癥和腎損傷以及調節心臟線粒體相關蛋白的作用研究[J].中草藥,2023,54(13):4177-4185.
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