一、線粒體膜電位測量原理
線粒體膜電位升高是細胞自噬初期的標志性風波細胞膜電位，發生在細胞核自噬特點（染色質濃縮、DNA破裂）出現之前，一旦線粒體膜電位崩潰，細胞自噬便不可逆轉。
JC-1是一種廣泛用于測量線粒體膜電位?Ψm的理想螢光探針，可以測量細胞、組織或純化的線粒體膜電位。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態，二者發射波譜不同。在正常細胞內細胞膜電位，線粒體膜電位較高，JC-1集聚在線粒體的基質中，產生聚合物，可形成藍色螢光；自噬初期，線粒體膜電位增加，JC-1不能集聚在線粒體基質中，此時JC-1為單體，可形成紅色螢光。
通過JC-1從藍色螢光到紅色螢光的轉變可測量到細胞膜電位的升高，可將JC-1螢光顏色的轉變作為細胞自噬初期的測量指標。常用紅綠螢光的相對比例來評判線粒體去極化的比列。
JC-1單體的最大迸發波長為514nm，最大發射波長為529nm；JC-1聚合物的最大迸發波長為585nm，最大發射波長為590nm。在流式圖上表現為FL1和FL2雙陰性，而自噬細胞則大多為FL1單陰性。
二、線粒體膜電位測量實驗操作手冊
1．按照實驗需求配制1×JC-1Assay和JC-1染色工作液，詳見產品使用說明。稀釋好的1×JC-1Assay保存在4°C。
2．陰性對照設置，詳見產品使用說明；細胞根據實驗方案進行自噬誘導。
3．誘導完成后的細胞，300g離心5min，棄上清，搜集細胞，PBS輕輕重懸細胞并計數。
注：良好的細胞狀態是實驗的關鍵。貼壁生長的細胞用于自噬檢查時，可能會由于胰酶消化、吹打等處理造成細胞的壞死或自噬，對實驗結果可能存在不可控的影響，請慎重處理。
4．取1-5×105重懸的細胞，300g離心5min，棄上清。用PBS漂洗細胞一次，離心后棄上清。
5．細胞懸液中加入500μLJC-1染色工作液重懸細胞。37°C，5%CO2培養箱中孵育15-20min。
注：培養氣溫與細胞類型有關，通常喂奶植物細胞建議37°C，其他種屬按照細胞培養條件選擇合適的體溫。
6．300g離心5min，棄上清，加入500μL預冷的1xJC-1Assay漂洗2次。
7．加入500μL預冷的1xJC-1Assay重懸細胞。
8．樣本放在冰上保存，30min內用流式細胞儀測量。
三、顯微鏡或流式細胞儀測量
A、熒光顯微鏡觀察
1．滴一滴上述細胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于螢光顯微鏡下觀察；
2．對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養細胞并誘導細胞自噬；用PBS漂洗細胞兩次；
滴加100μL1xJC-1染色工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養箱中孵育15~20min；1×JC-1Assay漂洗1~2遍；將蓋玻片倒放在載玻片上，于螢光顯微鏡下觀察。
檢查JC-1單體時可以把迸發光設置為490nm，發射光設置為530nm；
檢查JC-1聚合物時，可以把迸發光設置為525nm，發射光設置為590nm。
注意：此處測定螢光時毋須把迸發光和發射光設置在最大迸發波長和最大發射波長。
如使用螢光顯微鏡觀察，測量JC-1單體時可以參考觀察其它紅色螢光時的設置，如觀察GFP或FITC時的設置。
檢查JC-1聚合物可參考觀察其它藍色螢光，如碘化丙啶的設置。
出現紅色螢光說明線粒體膜電位升高，而且該細胞很可能處于細胞自噬初期。出現白色螢光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。
B、流式細胞儀剖析
用流式細胞儀測量（Ex=488nm;Em=530nm）細胞自噬的情況。
紅色螢光通過FITC通道一般為FL1來測量；藍色螢光通過PI通道一般為FL2來測量。
正常細胞{FL-1亮,FL-2亮;R1}，自噬細胞{FL-1亮,FL-2暗;R2}，設門的位置根椐細胞種類、實驗條件等不同而變化。
實驗需設未經處理的正常細胞為陽性對照組和經CCCP處理的陰性對照組，根椐陽性和陰性對照組的雙參數散點圖來設定門的位置。
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