(1) 暗視野顯微鏡
(2)體視顯微鏡
(3)熒光顯微鏡
(4) 相差顯微鏡
(5)倒置顯微鏡
(6) 偏光顯微鏡
(1) 暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡不具備觀察物體內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的功能,但可以區(qū)分0.004μm以上顆粒的存在和運動。 因此,常被用來觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)顆粒的運動。
暗視野顯微鏡的基本原理是廷德爾效應(yīng)。 當(dāng)一束光穿過暗室時,從垂直于入射光的方向可以在空氣中觀察到一條明亮的灰塵“路徑”。 這種現(xiàn)象就是丁達(dá)爾效應(yīng)。
普通光學(xué)顯微鏡上暗場顯微鏡更換為暗場聚光鏡后,由于聚光鏡內(nèi)部拋物面結(jié)構(gòu)的阻擋,照射到被檢物體表面的光線無法直接進入物鏡鏡頭和目鏡。 只有散射光可以通過,所以視野是黑暗的。 操作者通過目鏡觀察到的是被檢物體的衍射光圖像(圖1-2)。
使用暗視野顯微鏡的基本方法如下:
1、安裝暗場聚光鏡(或者用一張厚黑紙做遮光罩,放在普通顯微鏡的聚光鏡下即可得到暗場效果)。
2. 使用強光源,通常是顯微鏡燈,以防止直射光進入物鏡。
3、在聚光鏡和載玻片之間加入一滴雪松油,防止照明光在聚光鏡上完全反射而不能到達(dá)被檢查物體,造成暗場照明。
4、進行調(diào)心,即水平移動聚光鏡,使聚光鏡光軸與顯微鏡光軸嚴(yán)格一致。 升降聚光鏡,將聚光鏡的焦點(圖1-2中錐束的頂點)對準(zhǔn)被檢物體。
5、選擇與聚光鏡對應(yīng)的物鏡,調(diào)節(jié)焦距,像普通顯微鏡一樣操作。
(2)體視顯微鏡
體視顯微鏡也稱為實體顯微鏡或解剖顯微鏡。 其圖像為正立三維空間圖像,具有立體感強、圖像清晰寬廣、工作距離長(通常為110毫米)、連續(xù)放大觀看等特點。 在生物學(xué)中偏光顯微鏡補償器的作用,它常用于解剖學(xué)過程中的實時觀察(圖1-3)。
普通光學(xué)顯微鏡的光源是平行光,從而形成二維平面圖像; 而體視顯微鏡則采用雙通道光路,雙目鏡筒內(nèi)的左右光束具有一定的視角(通常為 ),從而形成三維空間的立體圖像。
體視顯微鏡的使用與普通光學(xué)顯微鏡類似,但更方便。 兩者之間的主要區(qū)別是:
1、體視顯微鏡檢查的對象無需制作成封片膜。
2、體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上,配有黑白雙面板或玻璃板。 操作者可根據(jù)顯微鏡的對象和要求進行選擇。
3、體視顯微鏡成像為直立,方便解剖操作。
4、體視顯微鏡只有一個物鏡,通過旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)螺桿可以連續(xù)調(diào)節(jié)其放大倍數(shù)。
(3)熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)出的熒光強度進行定性和定量研究的光學(xué)工具。
細(xì)胞中有兩種熒光物質(zhì)。 一類受紫外線照射后可直接發(fā)出熒光,如葉綠素。 還有一些物質(zhì)本身不具有這種性質(zhì),但如果用特定的熒光染料或熒光抗體染色,在受到紫外線照射后就會發(fā)出熒光。 照射后也可發(fā)出熒光(圖 1-4)。
熒光顯微鏡的原理是利用高光效點光源(如超高壓汞燈)通過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650λ或紫藍(lán)光4200λ)作為激發(fā)光來激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)。 各種顏色的熒光發(fā)出后,經(jīng)過物鏡后面的阻擋(或抑制)濾光片過濾,最后通過目鏡的放大倍數(shù)進行觀察。
阻擋濾光片有兩個作用:一是吸收并阻擋激發(fā)光進入目鏡,避免干擾熒光,損傷眼睛;二是吸收阻擋激發(fā)光。 另一種是選擇并讓特定的熒光通過,以顯示特定的熒光顏色。
熒光顯微鏡按光路原理可分為兩種:
1.透射熒光顯微鏡
在較舊的熒光顯微鏡中,激發(fā)光源通過聚光鏡穿過樣本材料以激發(fā)熒光。 優(yōu)點是低倍時熒光較強,缺點是隨著倍率增大熒光減弱。 因此只適合觀察較大的標(biāo)本材料。
2.落射熒光顯微鏡
激發(fā)光從物鏡向下落到樣品表面,即照明聚光鏡和收集熒光的物鏡使用同一物鏡(圖1-5)。
光路中需要添加二向色分光鏡(二向色鏡),與光軸成45°角。 激發(fā)光反射到物鏡中并聚集在樣品上。 樣品產(chǎn)生的熒光被物鏡和蓋子的表面反射。 載玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡,返回二向色分光鏡,將激發(fā)光和熒光分離。 然后剩余的激發(fā)光被阻擋濾光片吸收。 如果使用不同的激發(fā)濾光片/雙色分束器/阻擋濾光片組合插片,則可以滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需求。
這種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視場照明均勻,圖像清晰,放大倍數(shù)越大,熒光越強。
(4) 相差顯微鏡
相差顯微鏡是一種可以將光線通過物體時產(chǎn)生的相位差(或光程差)轉(zhuǎn)換為振幅(光強)變化的顯微鏡。 主要用于觀察活細(xì)胞、未染色的組織切片或缺乏對比度的染色標(biāo)本。
人眼只能識別可見光的波長(顏色)和振幅的變化,而不能識別相位的變化。 大多數(shù)生物標(biāo)本都是高度透明的,光波穿過它后振幅基本保持不變,只有相位發(fā)生變化。
相差顯微鏡基本上是將透過標(biāo)本的可見光的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睿瑥亩岣吒鞣N結(jié)構(gòu)之間的對比度,使各種結(jié)構(gòu)清晰可見。 光線穿過標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離原來的光路,并被延遲1/4λ(波長)。 如果增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光束合并后發(fā)生干涉。 加強、增加或減少幅度,并增加對比度(見圖 6)。
從結(jié)構(gòu)上看偏光顯微鏡補償器的作用,相差顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別是:
1、環(huán)形光闌有一個環(huán)形開口,安裝在光源和聚光鏡之間。 其作用是使通過聚光鏡的光線形成空心光錐并聚焦在標(biāo)本上。
2、相位板相差顯微鏡在物鏡內(nèi)部增加了一塊涂有氟化鎂的相位板,使直射光或衍射光的相位延遲1/4λ。 相位板上有兩個區(qū)域,直射光通過的部分稱為“共軛面”,衍射光通過的部分稱為“補償面”。 相位板按其工作作用分為兩種:
(1) A+相位板:使直射光延遲1/4λ。 兩組光波組合后,光波疊加,振幅增大。 標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更亮,形成亮對比度(或負(fù)對比度)。
(2) B+相位板:使衍射光延遲1/4λ。 兩組光線合成后,光波相減,振幅變小,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更暗,形成暗對比度(或正對比度)。 帶相位板的物鏡稱為相襯物鏡,在物鏡外殼上常標(biāo)有“Ph”字樣。
同軸可調(diào)望遠(yuǎn)鏡
相差顯微鏡配有同軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡(外殼上標(biāo)有“CT”符號),用于調(diào)節(jié)環(huán)形光闌,使圖像與相位板的共軛面完全一致,從而實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。 。
使用時,取下一側(cè)目鏡,插入望遠(yuǎn)鏡調(diào)軸,調(diào)整軸即可調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡的焦距,視野內(nèi)會出現(xiàn)兩個環(huán),即較亮的環(huán)形光圈環(huán)和較暗的環(huán)形光圈環(huán)。共軛在相位板上。 面環(huán)。 然后轉(zhuǎn)動聚光器上環(huán)形膜片的兩個調(diào)節(jié)螺釘,使兩個環(huán)完全重疊。 如果明亮的光暈太小或太大,請調(diào)節(jié)聚光鏡的升降旋鈕,使兩個環(huán)完美匹配。 如果聚光鏡已升到最高點或降到最低點仍無法校正,則說明載玻片太厚,應(yīng)更換。 調(diào)整完畢后,可以拆下同軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡,換上目鏡。
綠色濾光片
用于調(diào)節(jié)光源的波長。 不同波長的照明光會引起相位變化。 為了獲得良好的相襯效果,相襯顯微鏡需要使用波長范圍較窄的單色光,通常用綠色濾光片進行調(diào)節(jié)。
使用相差顯微鏡的步驟如下:
① 根據(jù)被檢樣品的性質(zhì)和要求,選擇合適的相襯物鏡。
② 將載玻片放置在載物臺上,調(diào)整光軸中心。
③利用望遠(yuǎn)鏡的同軸調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)環(huán)形光闌與相位板上的共軛面環(huán)完全重合,然后更換目鏡。 在觀察過程中,每次改變物鏡放大倍數(shù)時,都必須重新調(diào)整環(huán)形光闌以與相位板共軛面的環(huán)相匹配。
④ 加綠色濾光片,按照普通光學(xué)顯微鏡的操作步驟進行觀察。
(5)倒置顯微鏡
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)與普通顯微鏡基本相同,只是交換了物鏡和照明系統(tǒng)的位置。 前者在臺下,后者在臺上。 主要用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞,需要配備相差物鏡。
(6) 偏光顯微鏡
偏光顯微鏡可用于檢測雙折射物質(zhì),如染色體、膠原蛋白、纖維等(圖1-7)
與普通顯微鏡的區(qū)別在于:
① 偏光顯微鏡在光源前面裝有起偏器(偏光鏡),使進入顯微鏡的光發(fā)生偏振。
②鏡筒內(nèi)有檢偏器(檢偏器,偏光方向與偏光器垂直的偏光器)。
③ 使用旋轉(zhuǎn)臺。 當(dāng)單個折射物質(zhì)放置在載物臺上時,無論載物臺如何旋轉(zhuǎn),由于兩個偏光鏡是垂直的,因此在顯微鏡中看不到光。 當(dāng)放置雙折射物質(zhì)時,光穿過這種類型的材料。 物體被物體偏轉(zhuǎn),從而使旋轉(zhuǎn)臺能夠檢測到此類物體。
④ 配備補償器或相位膜;
⑤ 使用專用無應(yīng)力物鏡。
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