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(儀器博物館)激光共聚焦顯微鏡的“一切”

更新時間:2024-02-29 文章作者:佚名 信息來源:網(wǎng)絡整理 閱讀次數(shù):

#儀器博物館#是儀器信息網(wǎng)微信公眾號與儀器導購聯(lián)合打造的儀器科普專欄。 它每周都會推薦一種樂器。 本周是第36期。 (文末列出常見品牌)本期儀器博物館,我們來聊聊激光共焦顯微鏡的“一切”。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

“共焦顯微鏡”又稱“激光共焦顯微鏡”、“激光掃描共焦熒光顯微鏡”,是利用計算機、激光和圖像處理技術獲取生物樣本三維數(shù)據(jù)的最先進的分子和細胞生物學方法。 分析儀器。 主要用于觀察活細胞的結構和特定分子、離子的生物變化、定量分析、實時定量測定。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

今天小普就來探討一下它的發(fā)展歷史、結構原理、分類應用等,用一篇文章對共焦顯微鏡進行徹底的介紹。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

注:您還希望我們?yōu)槟男╊愋偷臉菲鹘ⅰ皹菲鞑┪镳^”? 請給小樸君留言。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

01“共焦顯微鏡”的歷史RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1957年,他提出了共焦顯微鏡技術的一些基本原理,并研制出了最早的共焦掃描顯微鏡原型,并在美國獲得專利。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

但當時缺乏合適的超強光源偏光顯微鏡法觀察聚合物球晶形態(tài),數(shù)據(jù)處理能力達不到要求的標準。 這個想法實際上只停留在理論階段。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

有趣的是,共焦技術遠非我們何先生最偉大的成就,他更被稱為“人工智能之父”,他發(fā)明了世界上第一個神經(jīng)網(wǎng)絡模擬器Snare、世界上第一個可以模擬人類活動的機器人Robot C、以及“虛擬現(xiàn)實”(VR)的倡導者。 。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

馬文·明斯基 ( )RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

明斯基開發(fā)的共焦掃描顯微鏡原型RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1967 年,Egger 和同事成功地使用共焦顯微鏡制作了光學橫截面。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1977年,首次描述了光與被照射物體原子之間的非線性關系以及激光掃描儀的拉曼光譜。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1978年,德國兄弟 ()和 ()首先提出了共焦激光掃描顯微鏡(Laser,簡稱CLSM)的設計:基于熒光顯微成像,配備激光掃描裝置,激光聚焦逐點掃描法與熒光標記生物樣品的三維檢測方法相結合,通過計算機處理(類似于掃描電子顯微鏡)重建三維圖像。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

左: ( ) 右: ( )RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1984年,該公司推出了世界上第一臺商業(yè)化的共焦顯微鏡,型號為SOM-100,采用步進式掃描方式。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1986 年,MRC-500 改進為光束掃描,并用作生物熒光顯微鏡的共焦系統(tǒng)。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1987年,White和Amos在英國《自然》雜志上發(fā)表了《共焦顯微鏡時代的來臨》一文,標志著LSCM已成為科學研究的重要工具。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

02“共焦顯微鏡”的結構及原理共焦顯微鏡的結構RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光掃描共焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號處理器、計算機和圖像輸出裝置。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1. 掃描模塊RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

掃描模塊主要由針孔光闌(控制光學片厚度)、分光鏡(根據(jù)波長改變光傳播方向)、熒光發(fā)射分色器(選擇一定波長范圍內(nèi)的光進行檢測)、探測器(光電倍增管)組成。 熒光樣品中的混合熒光進入掃描儀,經(jīng)過檢測針孔光闌、分光鏡和分色器的選擇后,分為單色熒光,在不同的熒光通道中進行檢測,形成相應的共焦圖像。 同時,計算機屏幕上可以顯示多個并排的單色熒光圖像及其合成圖像。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2. 熒光顯微鏡系統(tǒng)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

顯微鏡是LSCM的主要組成部分,關系到系統(tǒng)的成像質量。 顯微鏡光路采用無限遠光學系統(tǒng),可以輕松插入光學選件,而不影響成像質量和測量精度。 物鏡應采用大數(shù)值孔徑平復消色差物鏡,有利于熒光的采集和清晰的成像。 物鏡組的轉換、濾色片組的選擇、載物臺的移動和調節(jié)、焦平面的記憶鎖定等均應由計算機自動控制。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光掃描共焦顯微鏡中使用的熒光顯微鏡與常規(guī)熒光顯微鏡大體相同,但它有自己的特點:需要連接掃描儀,使激光進入顯微鏡物鏡照射樣品并允許樣品發(fā)出的熒光到達檢測器; 需要一個光路轉換裝置,即汞燈和激光轉換,而汞燈的光強是可調的。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3.常用激光器RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光掃描共焦顯微鏡使用的激光光源包括單激光和多激光系統(tǒng)。 常用的激光器包括以下三種類型:RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

半導體激光器:405nm(近紫外譜線)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

氬離子激光:457nm、477nm、488nm、514nm(藍綠光)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

氦氖激光器:543nm(綠光-氦氖綠激光器)633nm(紅光-氦氖紅激光器)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

UV激光(紫外激光):351nm、364nm(紫外光)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

4、輔助設備RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

風冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光掃描共焦顯微鏡的基本工作原理是激光器首先發(fā)出一定波長的激發(fā)光。 光經(jīng)過放大后,通過掃描儀內(nèi)的照明針孔光闌,形成點光源。 物鏡聚焦在樣品的焦平面上。 相應照射點發(fā)出的熒光被激發(fā),穿過檢測孔孔徑,到達檢測器,并在計算機顯示器屏幕上成像。 這樣,焦平面上樣品各點的熒光圖像就形成了完整的共焦圖像,稱為光切面。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光掃描共焦熒光顯微鏡相對于普通熒光顯微鏡的優(yōu)勢RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

(1)LSCM圖像以電信號的形式記錄,因此可以采用各種模擬和數(shù)字電子技術進行圖像處理;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

(2)LSCM利用共焦系統(tǒng),有效消除焦點外光信號的干擾,提高分辨率,顯著提高視場的寬度和深度,使無損傷光學切片成為可能,實現(xiàn)三維空間定位;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

(3)由于LSCM可以隨時采集并記錄檢測信號,為生命科學觀察活細胞結構和特定分子、離子的生物變化開辟了新途徑;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

(4)LSCM除了成像功能外,還具有圖像處理功能和細胞生物學功能。 前者包括光學切片、三維圖像重建、細胞物理和生物測量、熒光定量、定位分析和離子的實時定量測定。 ; 后者包括貼壁細胞的分選、激光細胞纖維手術和光阱技術、熒光漂白后的恢復技術等。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

共焦顯微鏡的成像原理RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

點光源用于照亮樣本,在焦平面上形成一個小而清晰的光斑。 光斑被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集,并沿原來的照射光路返回到由二向色鏡組成的分束器。 光譜儀將熒光直接發(fā)送至檢測器。 光源和檢測器前面各有一個針孔,分別稱為照明針孔和檢測針孔。 兩者的幾何尺寸一致,約為100-200nm; 相對于焦平面上的光點,兩者是共軛的,即光點經(jīng)過一系列透鏡,最終可以同時聚焦在照明針孔和檢測針孔上。 這樣,來自焦平面的光線可以集中在檢測孔的范圍內(nèi),而來自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外,無法成像。 用激光逐點掃描樣品,檢測針孔后面的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共焦圖像,轉換成數(shù)字信號傳輸?shù)接嬎銠C,最后聚合在屏幕變成整個焦平面的清晰共焦圖像。 。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

每個焦平面圖像實際上是樣本的光學橫截面。 該光學截面總是具有一定的厚度,也稱為光學薄片。 由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強,且非焦平面光被針孔過濾,因此共焦系統(tǒng)的景深近似為零。 沿Z軸方向掃描可以實現(xiàn)光學斷層掃描,在樣品的聚焦光斑處形成所需觀察的二維光學斷面。 將XY平面(焦平面)掃描與Z軸(光軸)掃描相結合,通過累積連續(xù)水平的二維圖像并用專門的計算機軟件進行處理,可以獲得樣品的三維圖像。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點,使得焦平面外激發(fā)的熒光無法進入檢測針孔。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光共焦的工作原理簡單的表達就是它采用激光作為光源。 在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎上,增加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置,系統(tǒng)由計算機控制,對數(shù)字圖像進行采集和處理。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

03“共焦顯微鏡”的分類RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

目前,根據(jù)共焦點相對于標本的移動方式,共焦顯微鏡可分為三種類型。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

最簡單的一種是在透鏡系統(tǒng)的光軸上固定一個發(fā)射極限點,控制其不發(fā)生,同時移動標本(標本掃描)(等,1989);RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

另一種是多點掃描式。 弧光燈發(fā)出的光沿著旋轉孔板精確定位,并并行掃描和檢測(Egger and,1967;Xiao and Kino,1987),這是旋轉盤共焦顯微鏡(spin disk);RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

最常見的類型是單點掃描,其中通過移動鏡子或使用聲光偏轉計使激光通過光柵偏轉(等人,1985)。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

04“共焦顯微鏡”的應用領域RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光共聚焦成像系統(tǒng)可用于觀察各種染色、未染色和熒光標記的組織和細胞,觀察和研究組織切片和活細胞的生長發(fā)育特征,研究和測量細胞內(nèi)的物質運輸和能量轉換。 能夠進行活細胞內(nèi)離子和pH值變化(RATIO)的研究、神經(jīng)遞質研究、微分干擾和熒光斷層掃描、多重熒光斷層掃描和疊加、熒光光譜分析、各種熒光指標的定量分析以及時間延遲熒光樣品組織、細胞三維動態(tài)結構成分掃描及動態(tài)成分、熒光共振能量轉移分析、熒光原位雜交研究(FISH)、細胞骨架研究、基因定位研究、原位實時PCR產(chǎn)物分析、熒光漂白恢復研究(FRAP)、細胞間通訊研究、蛋白質間通訊研究、膜電位和膜流動性研究等,完成圖像分析和三維重建等分析。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的應用領域包括醫(yī)學、動植物科學研究、生物化學、細菌學、細胞生物學、組織胚胎、食品科學、遺傳學、藥理學、生理學、光學、病理學、植物學、神經(jīng)科學、海洋生物學、材料科學、電子科學、力學、石油地質學、礦物學。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

在生物學領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

細胞形態(tài)分析(細胞或組織內(nèi)部微觀結構的觀察,如:細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體、微管、微絲、細胞橋、染色體等亞細胞結構的形態(tài)特征;半定量免疫熒光分析); 熒光原位雜交研究; 基因定位研究和三維重建分析。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1、細胞生物學:細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構及分布變化;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2.生物化學:酶、核酸、FISH(熒光原位雜交)、受體分析; 3.藥理學:藥物對細胞的影響及其動態(tài); 4.生理學:膜受體、離子通道、細胞內(nèi)離子含量、分布、動態(tài); 5、神經(jīng)生物學:神經(jīng)細胞結構、神經(jīng)遞質成分、運輸與傳遞、遞質受體、離子流入與流入、神經(jīng)組織結構、細胞分布; 6.微生物學和寄生蟲學:細菌和寄生蟲的形態(tài)結構; 7、病理學及臨床應用:活檢標本診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病診斷、HIV等; 8.遺傳學與組織胚胎學:細胞生長、分化、成熟變化、細胞三維結構、染色體分析、基因表達、遺傳診斷。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

醫(yī)療領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

A. 在神經(jīng)科學中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1、熒光定量測量; 2.細胞內(nèi)離子的測定; 3.神經(jīng)細胞形態(tài)觀察。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

B.在耳鼻喉科中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1.在內(nèi)耳毛細胞亞細胞結構研究中的應用;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2.激光掃描共焦顯微鏡熒光鈣測量技術在內(nèi)耳毛細胞研究中的應用;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3.激光掃描共聚焦顯微鏡在內(nèi)耳毛細胞離子通道研究中的應用;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

4.激光掃描共焦顯微鏡在嗅覺研究中的應用。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

C.在腫瘤研究中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1. 免疫熒光定量分析;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2. 細胞內(nèi)離子分析;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3.圖像分析:腫瘤細胞的二維圖像分析;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

4.三維重建。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

D. 激光掃描共聚焦顯微鏡在內(nèi)分泌領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1.細胞內(nèi)鈣離子的測定;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2. 免疫熒光定位和免疫細胞化學研究;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3.細胞形態(tài)研究:采用激光掃描共聚焦顯微鏡。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

E.在血液疾病研究中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1.在血細胞形態(tài)和功能研究中的應用;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2.在細胞凋亡研究中的應用。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

F. 在眼科研究中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1.利用激光掃描共焦顯微鏡觀察組織和細胞結構;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2、利用特殊熒光染色觀察體內(nèi)角膜創(chuàng)傷修復過程中的細胞遷移和成纖維細胞的出現(xiàn);RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3、利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜視神經(jīng)細胞的分布和神經(jīng)元的樹突形態(tài);RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

4.三維重建。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

G. 激光掃描共聚焦顯微鏡在腎臟疾病中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

它可以系統(tǒng)地觀察正常人腎小球系膜細胞的斷層圖像和三維成像水平,使圖像更加清晰。 計算機分析系統(tǒng)可以分析一切,從外觀到內(nèi)部結構,從平面到三維,從靜態(tài)到動態(tài),從形態(tài)到功能的幾個方面對系膜細胞的理解都有了提高。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

MEMS領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

微米和亞微米元件的尺寸測量、各種工藝(顯影、蝕刻、金屬化、CVD、PVD、CMP等)后的表面形貌觀察和缺陷分析。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

半導體/LCD領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

各種工藝(顯影、蝕刻、金屬化、CVD、PVD、CMP等)后的表面形貌觀察、缺陷分析、線寬、臺階深度等非接觸測量。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

在精密機械部件和電子設備領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

微米和亞微米部件的尺寸測量、各種表面處理工藝、焊接工藝后的表面形貌觀察、缺陷分析、顆粒分析。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

在摩擦學、腐蝕和其他表面工程領域的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

磨痕體積測量、粗糙度測量、表面形貌、腐蝕和亞微米表面工程后的表面形貌。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

在材料科學中的應用RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

新材料研發(fā)、缺陷分析、失效分析。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

05 關于“共焦顯微鏡”的常見問題 1. 掃描的最終圖像不清晰。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

出現(xiàn)此類問題的主要原因有兩個:RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1.物鏡和ZOOM值選擇不正確。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

大多數(shù)初學者用戶更喜歡使用10X物鏡,然后將ZOOM值調整到所需的最大值。 增加ZOOM值確實可以放大圖像,有助于清晰地看到圖像的細節(jié),但ZOOM的增加是有限的,具體取決于物鏡的放大倍數(shù)。 例如,在10X物鏡下,ZOOM值超過10是沒有意義的,ZOOM值的增加屬于電子放大。 放大倍數(shù)越高,清晰度越差。 因此,當觀察的樣品尺寸較小時,常采用高倍物鏡(如63X水鏡或油鏡),并適當調整ZOOM值。 ZOOM 值不應超過 2。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2. 錯誤地將Z軸旋轉球的功能等同于顯微鏡焦點微調旋轉器的功能。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

在準確調焦的基礎上,通過左右調節(jié)Z軸旋轉球,可以觀察到目標樣本圖像因Z軸距離變化而引起的圖像清晰度變化。 感覺就像通過調整焦距使圖像更清晰一樣。 因此,很多用戶直接使用旋轉球來調整圖像清晰度,而沒有準確調整焦距,導致圖像模糊。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2、掃描背景較強,圖像質量較差RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

解決這一問題的關鍵是根據(jù)樣品的制備質量選擇合適的針孔尺寸,并將激光管電壓、光電倍增管功率、信噪比等參數(shù)調整到最佳狀態(tài)。 這些參數(shù)或設置密切相關,選擇時應綜合考慮; 或使用 Aver key 和 Li.Ai。 掃描過程中圖像平滑和降噪的關鍵(即簡單的數(shù)學平均方法)。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

另一種方法是在此基礎上,圖像掃描完成后,利用LCS軟件中的圖像處理功能鍵調節(jié)亮度、對比度和灰度校正,并通過基線校正去除噪聲,以優(yōu)化圖像質量。 還有一種情況是,由于操作者用顯微鏡觀察熒光樣品后未能退出熒光濾光片并切換到掃描狀態(tài),導致明場出現(xiàn)環(huán)形波紋背景。 此時,只需轉動調節(jié)輪即可進行掃描。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3. 串色RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

當使用多種熒光染料標記樣品或樣品本身具有較強的自發(fā)熒光時,很容易發(fā)生顏色交叉污染。 串色分為兩種情況:RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

(1)兩種熒光染料的激發(fā)光譜不重疊,但吸收光譜重疊。 這種類型的串色可以通過順序掃描(也稱為序列掃描)來完成:即先使用一種熒光染料的激發(fā)光掃描一張圖片,然后使用另一種熒光染料的激發(fā)光掃描該章2 圖片。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

(2)兩種熒光染料的激發(fā)光譜和吸收光譜重疊。 這種情況只能通過光譜掃描來解決。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

4. 多熒光通道掃描圖像的保存及標尺值的舍入RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

保存多通道掃描圖像時,系統(tǒng)默認以不同的單通道顏色保存。 為了便于直觀觀察不同部位各種熒光的表達情況,我們還需要各種熒光疊加的合并圖像。 這時,只需點擊按鈕即可。 單次掃描圖像完成后,系統(tǒng)自動生成的標尺值大多數(shù)情況下都是非整數(shù)。 即使在保存圖像之前將它們修改為整數(shù),在后續(xù)掃描時,上一個圖像中修改的標尺值也會恢復為默認值。 非整數(shù)值。 要解決這個問題,還需要使用功能鍵。 即單次掃描完成并修改標尺值并舍入后,單擊按鍵顯示合并圖像,然后右鍵選擇圖片生成圖像。 這兩點很容易被新手用戶忽視。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

5、圖像掃描完成后,忘記重置各種參數(shù)。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

尤其是電子放大掃描后,很多操作人員忘記恢復ZOOM,導致下一次掃描樣品時無法觀察到顯示屏上的目標樣品。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

06 “共焦顯微鏡”的維護RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

1、嚴格按照共焦顯微鏡操作規(guī)則使用,避免因使用不當造成損壞。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

2、為了保持良好的工作狀態(tài),延長使用壽命,工作環(huán)境應保持清潔、干燥、遠離輻射源。 每次使用共焦顯微鏡后,應及時清潔目鏡、物鏡等易污染的光學部件。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

3、共焦顯微鏡系統(tǒng)應有專門的房間,并安裝在防震平臺上。 工作室應安裝空調、除濕、防塵裝置。 無論儀器是否工作,其環(huán)境最好保持在22℃±1℃的恒溫。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

4、注意保護儀器光纖,防止受到擠壓。 儀器常用備件和專用工具應由專人保管。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

5、共聚焦顯微鏡工作室必須常年保持清潔衛(wèi)生,操作人員必須穿拖鞋和工作服。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

6、用戶必須經(jīng)過培訓合格后,才能在管理人員的指導下使用共聚焦顯微鏡。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

07 選擇“共焦顯微鏡”的建議RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

共焦顯微鏡比寬視野顯微鏡有更多優(yōu)勢。 共焦顯微鏡可以對樣品進行連續(xù)光學切片并消除非焦平面的信號干擾。 因此,共焦顯微鏡確實更常用。 然而,市場上的各種共焦顯微鏡越來越多。 如何選擇? 選擇共聚焦顯微鏡時,最基本和重要的考慮因素主要有兩點:您想要研究的樣品類型(例如固定或活細胞),以及您想要執(zhí)行的檢測類型(例如靜態(tài)或動態(tài)細胞過程) )。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

固定細胞的共焦成像RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

為了對固定和染色的細胞或組織進行成像,我們通常選擇激光掃描共聚焦(LSCM)。 這主要是因為固定死細胞缺乏活細胞中的快速生物事件,可以更好地受益于LSCM更高的空間分辨率。 LSCM成像利用激光對樣品進行光學切片,掃描速度(取決于掃描陣列的速度)一般為1fps。 更長的曝光時間意味著更大的光漂白風險,但對于固定的死細胞,時間并不重要,我們可以通過拍攝多張圖像來平均。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

活細胞共聚焦成像RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

活細胞成像需要額外的保護,以免受不友好環(huán)境的干擾。 在成像時,我們首先需要考慮的是維持細胞的活性和健康。 恒溫加熱元件和灌注系統(tǒng)至關重要,特別是對于延時(時間序列)研究。 控制活細胞生理狀態(tài)的快速生化事件是大多數(shù)人想要研究的,但這些事件對于傳統(tǒng)的 LSCM 來說太快了。 此外,長期暴露于LSCM還會對細胞造成有毒光損傷。 因此,活細胞成像需要特殊的共聚焦顯微鏡。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

活細胞共焦成像通常有兩種選擇:快速掃描激光掃描共焦和轉盤共焦。 快速掃描共焦顯微鏡取代了較慢的共振掃描陣列(速率),該速度理論上是可以實現(xiàn)的(實踐中往往受到其他因素的限制)。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

如果您擔心光漂白或熒光信號非常弱,那么 SDCM 可能更合適。 SDCM利用兩個帶有陣列微孔的轉盤旋轉來分散激發(fā)光。 與LSCM逐點掃描樣本不同,SDCM一次采集多個點(約100個像素),因此速度大大提高,而且SDCM的光漂白性和光毒性較小。 不過,也可以采用快速掃描共焦,提高掃描速度,配合高靈敏度探測器,降低激發(fā)光能量,以降低光毒性。 這樣可以保證傳統(tǒng)共焦的豐富功能。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

自動共焦成像系統(tǒng)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

一些研究人員喜歡尋找修改顯微鏡以滿足其個人需求的方法。 一些研究人員根本對顯微鏡的工作原理不感興趣。 對于后者,自動共焦顯微鏡可能更符合他們的喜好。 這類儀器非常適合每天需要收集大量圖像數(shù)據(jù)的研究人員。 當然,它們并不能完全體現(xiàn)傳統(tǒng)共焦的功能和靈活的可擴展性。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

加深對各種共焦顯微鏡類型的了解可以幫助您找到最適合您應用的儀器。 如今,即使您不考慮全自動系統(tǒng),無論您選擇哪種型號,大多數(shù)系統(tǒng)都內(nèi)置了豐富的用戶友好功能偏光顯微鏡法觀察聚合物球晶形態(tài),可以讓您受益匪淺。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

如今,共焦顯微鏡不斷向更快、更靈敏、更高分辨率和更好的可擴展性發(fā)展,新技術不斷涌現(xiàn)。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

速度方面有共振快速掃描頭和轉盤共焦;RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

靈敏度方面,有AOBS光譜系統(tǒng)和更靈敏的探測器(HyD、GaAsp PMT);RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

分辨率方面,有超高分辨率(SIM、STED、PALM、STORM);RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

此外,還有多光子、白光激光、SMD等技術。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

在選擇共焦系統(tǒng)時,我們可以聽聽各個廠家的介紹,以便我們了解這些技術,并根據(jù)我們可能進行的研究來選擇最合適的儀器。 (作者:史密斯)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

08“共焦顯微鏡”常見品牌RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

至此,相信您對共焦顯微鏡已經(jīng)有了深刻的了解。 目前有哪些品牌的共焦顯微鏡? 哪些最受關注? (按品牌縮寫字母順序排列)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

A.奧林巴斯RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

產(chǎn)品:RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

激光掃描共焦顯微鏡LEXT等RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ 激光掃描共焦顯微鏡LEXT。 蔡司RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

產(chǎn)品:RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

高效共焦成像系統(tǒng) LSM 900,配備 2RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

共焦顯微鏡等RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ 高效共焦成像系統(tǒng) LSM 900 配備 2RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

C.基恩士RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

產(chǎn)品:RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

形狀測量激光顯微鏡VK-X3000等RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ 形狀測量激光顯微鏡VK-。 (尼維斯)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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共焦顯微鏡等RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ 共焦顯微鏡。 尼康RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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快速轉盤共聚焦顯微鏡系統(tǒng) CSU-SDRLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

A1+激光共焦顯微鏡等RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ 快速轉盤共聚焦顯微鏡系統(tǒng) CSU-SDF。 牛津儀器RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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高速共焦成像平臺 Andor 等人。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ 高速共焦成像平臺Andor。 陽光明媚RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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CSIM 100共焦掃描成像模塊(系統(tǒng))等RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

▲ CSIM 100共焦掃描成像模塊(系統(tǒng))RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

本文所介紹的品牌由儀器信息網(wǎng)的儀器購物指南提供。RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

大數(shù)據(jù)綜合計算(品牌指數(shù)、3i指數(shù)等)RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

解釋的最后權利屬于儀器信息網(wǎng)絡09個較大的“復活節(jié)彩蛋”RLl物理好資源網(wǎng)(原物理ok網(wǎng))

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