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利用熒光顯微鏡測定膜電位的方法和標準曲線曲線制作

更新時間:2023-11-22 文章作者:佚名 信息來源:網絡整理 閱讀次數:

細胞電位在細胞通信中有著重要的作用,本人整理了下借助螢光顯微鏡測定膜電位的方式、用酶標儀測定膜電位的方式以及膜電位的標準曲線制做。6en物理好資源網(原物理ok網)

膜電位測定6en物理好資源網(原物理ok網)

I.用螢光顯微鏡測定膜電位的方式6en物理好資源網(原物理ok網)

1.試劑6en物理好資源網(原物理ok網)

·(3)6en物理好資源網(原物理ok網)

·’sMEM(DMEM)6en物理好資源網(原物理ok網)

·FBS(fetalserum)6en物理好資源網(原物理ok網)

2.方式6en物理好資源網(原物理ok網)

1)將消化好的細胞移至DMEM中。6en物理好資源網(原物理ok網)

2)加入FBS,控制含量范圍在:2-15%。6en物理好資源網(原物理ok網)

3)加入(3),控制含量范圍在:1-5μmol/l。6en物理好資源網(原物理ok網)

4)用螢光顯微鏡觀察剌激后螢光硬度的變化。[Ar激光(488nm)的激光共聚焦顯微鏡],因為(3)的螢光會隨氣溫變化而改變細胞膜電位,所以必須在37℃的條件下測定。因為細胞膜的電位會變化,可以觀察細胞質內的螢光硬度變化。6en物理好資源網(原物理ok網)

II.用酶標儀測定膜電位的方式6en物理好資源網(原物理ok網)

1.試劑6en物理好資源網(原物理ok網)

·(3)6en物理好資源網(原物理ok網)

測量用緩沖液(pH7.4;20mmol/lHEPES,120mmol/lNaCl,2mmol/lKCl,2mmol/lCaCl2,1mmol/lMgCl2,6en物理好資源網(原物理ok網)

5mmol/l)6en物理好資源網(原物理ok網)

2.方式6en物理好資源網(原物理ok網)

1)培養細胞:在多孔板中培養細胞6en物理好資源網(原物理ok網)

2)清洗細胞:用含5μmol/l(3)的檢查用緩沖液200μl,清洗多孔板中培養的細胞2次6en物理好資源網(原物理ok網)

3)染色:在孔板中加入180μl含5μmol/l(3)的檢查用緩沖液,在5%CO2,37℃培養箱中孵育306en物理好資源網(原物理ok網)

分鐘。6en物理好資源網(原物理ok網)

4)測定:用螢光酶標儀觀察剌激后螢光硬度的變化。因為(3)的螢光會隨氣溫變化而改變,所以必6en物理好資源網(原物理ok網)

須在37℃的條件下測定,加入20μl含(3)的檢查用緩沖液,每隔30秒測定1次螢光變化。6en物理好資源網(原物理ok網)

III.膜電位的標準曲線6en物理好資源網(原物理ok網)

1.原理6en物理好資源網(原物理ok網)

膜電位變化時色素的分布也急劇變化,所以螢光和吸收也會變化。這些變化程度取決于色素的分子數和細胞數的百分比、色素的含量以及細胞的種類。膜電位的標準曲線是通過用電極直接測定目的細胞的膜電位,在該電位所測得的螢光和吸收硬度而制得的。6en物理好資源網(原物理ok網)

2.試劑6en物理好資源網(原物理ok網)

·(3)6en物理好資源網(原物理ok網)

·Eagle-6en物理好資源網(原物理ok網)

·PBS6en物理好資源網(原物理ok網)

3.方式6en物理好資源網(原物理ok網)

1)用Eagle-培養細胞。6en物理好資源網(原物理ok網)

2)取PBS中的細胞在37℃的CO2培養箱中孵育30-60分鐘,之后改變孵育時間,制備不一樣的CO2含量的樣品。6en物理好資源網(原物理ok網)

3)加入(3),終含量為2μmol/l。6en物理好資源網(原物理ok網)

4)20分鐘后,在517nm測定各個含量的螢光硬度,并用電極直接測定此時的電位差。6en物理好資源網(原物理ok網)

5)用螢光硬度和對應的電位差來制做標準曲線。6en物理好資源網(原物理ok網)

4.其他方式6en物理好資源網(原物理ok網)

有鉀擴散電位和螢光或吸收硬度比較的方式。纈氨霉素導致鉀擴散電位,鉀擴散電位(V)是根據等式估算如下:6en物理好資源網(原物理ok網)

V=-RT/Flog[K+]in/[K+]out=-59log[K+]in/[K+]out(mV)6en物理好資源網(原物理ok網)

所以在纈氨霉素存在時,通過改變細胞外鉀離子含量和細胞內鉀離子含量,估算擴散電位,測定各個電位的螢光或吸收硬度細胞膜電位,比較后可以得到標準曲線。6en物理好資源網(原物理ok網)

細胞膜電位和細胞自噬有著密不可分的關系,假如細胞膜電位崩潰還會出現細胞自噬。目前研究最多的是線粒體和細胞自噬的關系,研究線粒體膜電位可以借助螢光顯微鏡,也可以借助流式細胞儀。6en物理好資源網(原物理ok網)

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