你們好，明天給你們介紹一篇上的文章，標題是“Afor–oncell”，通信作者是加洲學院戴維斯校區的B.。院士的主要研究方向是糖質譜組學。本文介紹了一種抗體抗原毗鄰標記(AAPL)方式，該方式可以勾畫抗體互相作用位點以及抗原靶蛋白的互相作用位點。作為一種概念的證明，AAPL被證明使用鈉/鉀轉運ATP酶()和表皮生長因子受體2(ERBB2)特異性抗原，用Fe(III)催化探針修飾。一旦與目標蛋白結合，Fe(III)誘導的催化氧化發生在抗體表位附近。之后使用氧化蛋白質組學剖析來確定氧化程度，氧化位點在目標抗體，以及緊靠目標抗體的互作蛋白。對每位蛋白質進行AAPL評分，得出氧化的特異性和互作蛋白質與目標抗體的相關程度。為了驗證其療效，AAPL方式被用于勾畫結腸炎細胞中鈣黏附素(LI-,CDH17)的互作網路。
細胞膜蛋白互相作用在訊號轉導和其他基本的生物學途徑中是必不可少的。基于質譜的方式，如親和純化質譜（AL-MS）和交聯質譜（XL-MS）近些年來常被用作蛋白-蛋白互相作用的表征。借助過抒發表位標記的誘餌蛋白（Bait），可以實現AL-MS的富集過程，從而進行MS鑒別，但是弱互相作用難以通過AL-MS來捕捉。XL-MS通過光或物理交聯過程使交聯探針與靶蛋白產生共價聯接，能同時捕捉強或弱互相作用。
基于質譜的毗鄰標記結合蛋白質組學技術是另一種廣泛用于偵測蛋白質互相作用的方式。通過將目標蛋白與特定的酶或催化探針融合，將定位在互相作用位點附近的蛋白通過催化反應進行標記，之后用定量蛋白質組學進行表征。借助毗鄰標記蛋白質組學，可以辨識出與目標物具有強或弱相互作用的蛋白。作者開發了抗體抗原毗鄰標記(AAPL)技術，通過緊鄰依賴氧化來勾畫抗體的表位以及抗體的互作網路。作者提出了2種修飾方式即和FeAb，其中通過β-半乳香豆素酶酯化抗原末端半乳香豆素鍵，再借助UDP-與GalT-Y289L使抗原帶上疊氮基，在與DBCO-分子發生SPAAC反應后，抗原最終帶有Fe(III)。FeAb即直接通過Br-對抗原上半胱谷氨酸羧基發生鹵素加成，最終分子聯接到抗原。（1）
1和FeAb的制備流程
作者使用辨識Na+/K+ATP酶或則表皮生長因子受體2的抗原作為概念驗證。通過定量的氧化蛋白質組學剖析來檢測目標抗體及其相關蛋白的氧化，以優化特異性標記的反應條件。（2）
2APPL方式標記的原理
糖組學剖析表明，和FeAb中含疊氮官能團的聚糖約占所有類型聚糖的50%，免疫螢光成像證明修飾前后抗原的靶點結合能力不變。同時為了避免二溴化和非特異性氧化反應，作者進行了一系列的條件優化，通過被氧化肽段的硬度估算每位蛋白結合位點的氧化程度，用EPO（of）值代表，最終發覺在不同的細胞系和抗原修飾方法等條件下須要使用的氧化條件并不完全相同。
AAPL-MS的打分方法參考了AP-MS中的譜圖計數法，使用拓撲學分數（TopS）作為AAPL打分結果。該分數>0則覺得氧化位點相對于對照組更有特異性。作者也提及對于不同的蛋白，雖然AAPL分數在同一范圍，其氧化位點數也并不完全一致。
為了驗證AAPL打分的確切性，作者將和ERBB2互作分子的分類結果與數據庫進行比較，則是按照導入文獻數據提供基于蛋白質之間互相作用程度的得分。在數據庫中，作者將具有高置信區間（分數>0.7）和中置信區間（分數0.4~0.7）的蛋白分別歸為T1和T2，二級互相作用，即與T1,T2有互作但并不直接和或ERBB2有互作的蛋白歸為T3，其余的氧化蛋白定義為T4。作者將T1，T2的AAPL打分進行對比，發覺相對于其它蛋白確實具有更高的分數。T1和T2的EPO差別倍數也被探究，T1和T2所有互作蛋白的AAPL打分均>0，對于EPO差別倍數在1.5~5細胞膜蛋白，而對于ERBB2的EPO差別倍數在1.5~3。這證明AAPL打分與基于數據庫的打分結果一致。（3）
3借助和APPL對和ERBB2抗原的互作蛋白進行剖析
為了驗證基于AAPL鑒別和ERBB2抗原的互作蛋白是否和和ERBB2相關，作者進行了GO剖析。對于互作蛋白，GO剖析表明，多個基因屬于參與跨膜轉運蛋白活性和寬孔通道活性的蛋白組，這種蛋白組與的功能相關。而ERBB2和4個功能有關，分別是裂合酶，多肽轉移酶，載脂蛋白結合和大分子跨膜轉運體活性。
4借助GO對和ERBB2抗原的互作蛋白功能進行注釋
作者將APPL在CDH17中進行驗證，該蛋白在肝和小腸都高抒發，此前有文獻報導CDH17介導的細胞集聚與細胞質互作無關。作者使用了Caco-2細胞系，未分化的Caco-2是結結腸腫瘤細胞系，分化后具有小腸上皮細胞的特點。有趣的是，在未分化的Caco-2細胞系中，很難通過CDH17使用AAPL找到氧化蛋白，而在分化細胞系中則很容易找到細胞膜蛋白，作者覺得這是因為CDH17本身抒發量高低造成能結合的修飾抗原數不同，但這也從側面反映了AAPL的特異性。在中被預測為T1的蛋白，在AAPL中并不屬于L1或L2，這與之前報導的CDH17介導的細胞集聚過程相對獨立于其它鈣黏蛋白的報導一致。在T2中，PTPN1和VTNC在AAPL中被同時鑒別下來，有文獻報導兩者被覺得和E-鈣黏蛋白互作網路相關。T3和T4也被研究（Fig5A），并進行GO剖析（Fig5B），并發覺其中一些蛋白具有整合素結合功能。
5A.借助和APPL對CDH17的互作蛋白進行預測剖析B.使用GO剖析注釋CDH17互作蛋白的功能
作者進一步探究了CDH17糖基化與互作網路的關系。往年的糖蛋白組學剖析發覺Caco-2分化細胞系的CDH17糖基化程度相對于未分化系更高。CDH17的糖基化修飾70%都是唾液酸化的巖藻糖，巖藻糖化的糖肽占到了19%，富含3%的高甘露糖型糖肽，和少部份的中性糖肽。而未分化的Caco-2細胞系具有更高比列的高甘露糖型糖肽和更少的唾液巖藻糖化糖肽。
作者分別使用了α-甘露鞣質酶抑制劑幾夫堿（Kif）和唾液酸轉移酶抑制劑3Fax-，并發覺Kif使CEAM1,ATLA3,1A02,andVTNC的EPO值升高，提示這種蛋白與CDH17的互作增加，但STT3A和NOMO2的EPO并不升高。使用ST抑制劑時，也有類似的變化，即前幾種蛋白EPO值均下降。通過糖蛋白組學剖析發覺前4種蛋白本底為高唾液酸化修飾，而后2種蛋白本底為高甘露糖型修飾，這解釋了糖基化抑制劑處理造成的EPO程度不同的緣由，同時也表明CDH17的糖基化水平對其蛋白互作有較大影響。
其實，作者提出了一種Fe(III)修飾抗原用于研究細胞表面蛋白-蛋白互相作用的方式，通過與其它數據庫及打分方法的對比驗證了技巧特異性，并以CDH17作為驗證，探究糖基化水平在蛋白互作中發揮的作用。
