約30％的編碼基因編碼的膜蛋白（MPs）在諸多生理過程中起著至關(guān)重要的作用。膜蛋白是超過FDA批準(zhǔn)抗生素一半的靶標(biāo)抗生素。須要在近乎生理?xiàng)l件下對(duì)功能性膜蛋白進(jìn)列寬碼率的結(jié)構(gòu)研究，以提供深入的機(jī)理理解并推動(dòng)抗生素發(fā)覺。隨著單粒子冷藏顯微鏡（cryo-EM）的幀率革命，分離的膜蛋白的結(jié)構(gòu)闡釋已取得了快速進(jìn)展。下一個(gè)挑戰(zhàn)是保留電物理梯度和膜曲率，便于對(duì)膜蛋白進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)闡釋，而膜蛋白的生物學(xué)功能依賴于這種物理和數(shù)學(xué)特點(diǎn)。
2020年7月17日，顏寧團(tuán)隊(duì)在PNAS在線發(fā)表題為“Cryo-EMofainthe”的研究論文，該研究以特點(diǎn)明晰的AcrB為原型，提出了一種便捷的工作流程，用于對(duì)嵌入脂類體中的膜蛋白進(jìn)行冷藏-EM結(jié)構(gòu)剖析。結(jié)合優(yōu)化的蛋白脂類體分離，冷藏樣品制備和有效的顆粒選擇策略，以3.9的幀率獲得了嵌入脂類體中的AcrB的三維（3D）重建。該研究方式可廣泛應(yīng)用于具有奇特可溶性域的膜蛋白的冷藏EM剖析，為功能受跨膜電物理梯度或膜曲率影響的整體或外圍膜蛋白的冷藏EM剖析奠定了基礎(chǔ)。
另外，2020年6月15日，顏寧及楊洪遠(yuǎn)共同通信在Cell在線發(fā)表題為“BasisofLow-pH-byNPC1andNPC2”的研究論文，該研究闡明了低pH依賴性固醇從NPC2傳遞到NPC1跨膜（TM）域的分子基礎(chǔ)。在pH8.0時(shí)，在納米光碟和去污劑中分別獲得3.6和3.0碼率的NPC1類似結(jié)構(gòu)，闡明了聯(lián)接N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和跨膜膽固醇傳感器結(jié)構(gòu)域（SSD）的隧洞結(jié)構(gòu)；在pH5.5時(shí)，NTD表現(xiàn)出兩個(gè)氫鍵，表明固醇向隧洞輸送的運(yùn)動(dòng)。在通道的膜邊界發(fā)覺了一個(gè)假設(shè)的固醇分子，TM2向SSD上的表面袋產(chǎn)生。最后，在pH5.5時(shí)獲得了幀率為4.0的NPC1-NPC2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，揭示了尿酸從NPC2轉(zhuǎn)移到NPC1（NTD）的分子基礎(chǔ)。
2020年6月8日，顏寧團(tuán)隊(duì)在PNAS在線發(fā)表題為“forcryo-EMoftoxinon-gatedNa+in”的研究論文，該研究介紹在漂洗劑絡(luò)合物和納米圓盤中的單粒子冷藏電子顯微鏡（cryo-EM）剖析。在兩種條件下，的構(gòu)型與潛在滅活的NavAb的構(gòu)型幾乎相同。確定納米光碟中的結(jié)構(gòu)使研究人員才能檢測(cè)脂類單層中Nav通道的門控修飾劑毒素（GMT）。為了研究喂奶植物Nav通道中的GMT，該研究生成了一個(gè)嵌合體，其中Nav1.7的第二個(gè)電流感測(cè)域中S3和S4區(qū)段的細(xì)胞外片斷替換了中的相應(yīng)序列。此解決方案可實(shí)現(xiàn)毒素對(duì)接的可視化。為此，可以用作膜環(huán)境中GMT與Nav通道之間互相作用的結(jié)構(gòu)研究的方便代替品。
2020年5月13日，顏寧等團(tuán)隊(duì)在在線發(fā)表題為”basisforandofhumanACAT1“的研究論文，該研究介紹了人類ACAT1的冷藏電子顯微鏡結(jié)構(gòu)。每位都由九個(gè)跨膜段組成，這種段包圍了一個(gè)胞質(zhì)通道和一個(gè)在預(yù)計(jì)的催化位點(diǎn)會(huì)聚的跨膜通道。結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的突變剖析的證據(jù)表明，乙酰輔酶A通過細(xì)胞質(zhì)通道步入活性位點(diǎn)，而尿酸可能從側(cè)面通過跨膜通道步入。這些結(jié)構(gòu)和生化特點(diǎn)有助于合理化ACAT1對(duì)不飽和羰基鏈的偏好，并提供對(duì)MBOAT家族中酶催化機(jī)制的看法。
2020年5月13日，顏寧等團(tuán)隊(duì)在在線發(fā)表題為”andofhuman-“的研究論文，該研究介紹了人類DGAT1的冷藏電子顯微鏡結(jié)構(gòu)。每位DGAT1都有9個(gè)跨膜螺旋，其中8個(gè)產(chǎn)生保守的結(jié)構(gòu)折疊，將其命名為MBOAT折疊。DGAT1中的MBOAT折疊在膜中產(chǎn)生一個(gè)中空腔室細(xì)胞膜糖蛋白，該腔室包圍著高度保守的催化殘留物。該腔室有兩個(gè)底物，脂肪硝基輔酶A和二甲基甘油的單獨(dú)入口。DGAT1可以同型二聚體或同型四聚體方式存在，兩種方式具有相像的酶活性。DGAT1的N末端與毗鄰的互相作用，而這種互相作用是酶促活性所必需的。
生物膜包圍著拓?fù)涓綦x的隔室，包括細(xì)胞和細(xì)胞器，并為各類完整的和外圍的膜蛋白（MP）提供了棲居地。這種化學(xué)屏障使生命必需的電物理梯度得以生成和維持，這是因?yàn)殡x子和物理物質(zhì)在整個(gè)不可滲透膜上的不對(duì)稱分布所致。各類生理過程都取決于這種梯度，比如由質(zhì)子梯度（質(zhì)子動(dòng)力）驅(qū)動(dòng)的三乙酸腺苷（ATP）合成和依賴跨膜電場(chǎng)存在的動(dòng)作電位。為此，許多膜蛋白，比如電流門控離子通道（VGIC）以及一級(jí)和二級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，都依賴于跨膜電物理梯度來執(zhí)行其生物學(xué)功能。
不僅留駐在膜的內(nèi)部或表面之外，膜蛋白與膜之間的互相作用也對(duì)細(xì)胞壽命形成了深遠(yuǎn)的影響。諸如，許多外周膜蛋白定義了細(xì)胞器產(chǎn)生的膜輪廓。FoF1ATP合酶的二聚化在打造線粒體中起著重要作用。機(jī)械敏感通道通過部份由膜變型施加的機(jī)械力控制。
當(dāng)X射線晶體學(xué)是確定結(jié)構(gòu)的主要方式時(shí)，解析膜蛋白的結(jié)構(gòu)以前極具挑戰(zhàn)性。必須從斷裂的膜中純化出高度均質(zhì)的膜蛋白，并用悉心選擇的去污劑替代以結(jié)晶。自2013年以來，冷藏電子顯微鏡（cryo-EM）單顆粒剖析（SPA）已成為膜蛋白高幀率結(jié)構(gòu)解析的主流手段。已應(yīng)用多種試劑將膜蛋白溶化為單個(gè)顆粒以進(jìn)行剖析。不僅去污劑微團(tuán)外，兩親，納米圓盤和苯乙烯-馬來酸脂類顆粒（SMALP）封閉的帶有天然膜的納米圓盤也已用于成功的膜蛋白冷藏-EM結(jié)構(gòu)剖析。
雖然取得了這種進(jìn)步，但所有上述膜蛋白分離方式都破壞了膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，雖然在SMALP環(huán)繞的帶有天然膜片的納米盤的情況下，也清除了任何現(xiàn)有的電物理梯度和膜曲率。為了保留那些重要特點(diǎn)，使用電子冷藏?cái)鄬訏呙瑁╟ryo-ET）的原位結(jié)構(gòu)剖析可能是最終的解決方案。但是，當(dāng)前的技術(shù)障礙制止了使用cryo-ET的高幀率原位結(jié)構(gòu)測(cè)定。另一種取代策略是研究嵌入脂類體中膜蛋白的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)已廣泛用于膜蛋白的功能剖析。
雖然使用蛋白脂類體進(jìn)行了廣泛的功能表征，但僅有有限的嘗試將這些系統(tǒng)用于膜蛋白的結(jié)構(gòu)闡釋。在過去的六年中，早已開發(fā)了例如隨機(jī)球狀約束（RSC）之類的方式來研究具有改進(jìn)SPA策略的蛋白脂類體系統(tǒng)。并且，要在兩個(gè)報(bào)告中執(zhí)行精確的角度分配或訊號(hào)加法，目標(biāo)蛋白脂類體必須是接近完美的圓球，這是很難獲得的前提條件。兩種方式都還須要對(duì)原始圖象進(jìn)行額外的預(yù)處理步驟。
為了將cryo-EM用于嵌入或附著在脂類體上的膜蛋白的結(jié)構(gòu)剖析，有必要為膜蛋白摻入，冷藏樣品制備和cryo-EM數(shù)據(jù)處理開發(fā)高度可重復(fù)且便捷的工作流程。因此，研究人員選擇了來自大腸弧菌的經(jīng)過充分研究的耐多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB作為方式開發(fā)的原型。質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)的AcrB是一種三聚體，分子量約為350kDa。它是雖然在低含量和低含量下也最適于結(jié)晶的膜蛋白之一。為此，AcrB的結(jié)構(gòu)是在初期確定的。到目前為止，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中使用X射線晶體學(xué)和單顆粒冷藏EM方式測(cè)定的AcrB結(jié)構(gòu)超過100種細(xì)胞膜糖蛋白，為結(jié)構(gòu)驗(yàn)證提供了極好的參考。
在這項(xiàng)研究中，報(bào)告了一種工作流程，該流程具有優(yōu)化的脂類體分離，高溫樣品制備，深層二維（2D）分類，用于數(shù)據(jù)處理。使用該研究的簡(jiǎn)化方式，獲得了3.9碼率的蛋白脂類體中AcrB的重建。該工作流程可輕松推廣到蛋白脂類體中膜蛋白的結(jié)構(gòu)測(cè)定中，并為使用蛋白脂類體系統(tǒng)在受控的電物理勢(shì)或膜曲率存在下膜蛋白的結(jié)構(gòu)剖析奠定基礎(chǔ)。
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