約30％的編碼基因編碼的膜蛋白（MPs）在諸多生理過程中起著至關重要的作用。膜蛋白是超過FDA批準抗生素一半的靶標抗生素。須要在近乎生理條件下對功能性膜蛋白進列寬碼率的結構研究，以提供深入的機理理解并推動抗生素發覺。隨著單粒子冷藏顯微鏡（cryo-EM）的幀率革命，分離的膜蛋白的結構闡釋已取得了快速進展。下一個挑戰是保留電物理梯度和膜曲率，便于對膜蛋白進行全面的結構闡釋，而膜蛋白的生物學功能依賴于這種物理和數學特點。
2020年7月17日，顏寧團隊在PNAS在線發表題為“Cryo-EMofainthe”的研究論文，該研究以特點明晰的AcrB為原型，提出了一種便捷的工作流程，用于對嵌入脂類體中的膜蛋白進行冷藏-EM結構剖析。結合優化的蛋白脂類體分離，冷藏樣品制備和有效的顆粒選擇策略，以3.9的幀率獲得了嵌入脂類體中的AcrB的三維（3D）重建。該研究方式可廣泛應用于具有奇特可溶性域的膜蛋白的冷藏EM剖析，為功能受跨膜電物理梯度或膜曲率影響的整體或外圍膜蛋白的冷藏EM剖析奠定了基礎。
另外，2020年6月15日，顏寧及楊洪遠共同通信在Cell在線發表題為“BasisofLow-pH-byNPC1andNPC2”的研究論文，該研究闡明了低pH依賴性固醇從NPC2傳遞到NPC1跨膜（TM）域的分子基礎。在pH8.0時，在納米光碟和去污劑中分別獲得3.6和3.0碼率的NPC1類似結構，闡明了聯接N端結構域（NTD）和跨膜膽固醇傳感器結構域（SSD）的隧洞結構；在pH5.5時，NTD表現出兩個氫鍵，表明固醇向隧洞輸送的運動。在通道的膜邊界發覺了一個假設的固醇分子，TM2向SSD上的表面袋產生。最后，在pH5.5時獲得了幀率為4.0的NPC1-NPC2復合物的結構，揭示了尿酸從NPC2轉移到NPC1（NTD）的分子基礎。
2020年6月8日，顏寧團隊在PNAS在線發表題為“forcryo-EMoftoxinon-gatedNa+in”的研究論文，該研究介紹在漂洗劑絡合物和納米圓盤中的單粒子冷藏電子顯微鏡（cryo-EM）剖析。在兩種條件下，的構型與潛在滅活的NavAb的構型幾乎相同。確定納米光碟中的結構使研究人員才能檢測脂類單層中Nav通道的門控修飾劑毒素（GMT）。為了研究喂奶植物Nav通道中的GMT，該研究生成了一個嵌合體，其中Nav1.7的第二個電流感測域中S3和S4區段的細胞外片斷替換了中的相應序列。此解決方案可實現毒素對接的可視化。為此，可以用作膜環境中GMT與Nav通道之間互相作用的結構研究的方便代替品。
2020年5月13日，顏寧等團隊在在線發表題為”basisforandofhumanACAT1“的研究論文，該研究介紹了人類ACAT1的冷藏電子顯微鏡結構。每位都由九個跨膜段組成，這種段包圍了一個胞質通道和一個在預計的催化位點會聚的跨膜通道。結構指導的突變剖析的證據表明，乙酰輔酶A通過細胞質通道步入活性位點，而尿酸可能從側面通過跨膜通道步入。這些結構和生化特點有助于合理化ACAT1對不飽和羰基鏈的偏好，并提供對MBOAT家族中酶催化機制的看法。
2020年5月13日，顏寧等團隊在在線發表題為”andofhuman-“的研究論文，該研究介紹了人類DGAT1的冷藏電子顯微鏡結構。每位DGAT1都有9個跨膜螺旋，其中8個產生保守的結構折疊，將其命名為MBOAT折疊。DGAT1中的MBOAT折疊在膜中產生一個中空腔室細胞膜糖蛋白，該腔室包圍著高度保守的催化殘留物。該腔室有兩個底物，脂肪硝基輔酶A和二甲基甘油的單獨入口。DGAT1可以同型二聚體或同型四聚體方式存在，兩種方式具有相像的酶活性。DGAT1的N末端與毗鄰的互相作用，而這種互相作用是酶促活性所必需的。
生物膜包圍著拓撲隔離的隔室，包括細胞和細胞器，并為各類完整的和外圍的膜蛋白（MP）提供了棲居地。這種化學屏障使生命必需的電物理梯度得以生成和維持，這是因為離子和物理物質在整個不可滲透膜上的不對稱分布所致。各類生理過程都取決于這種梯度，比如由質子梯度（質子動力）驅動的三乙酸腺苷（ATP）合成和依賴跨膜電場存在的動作電位。為此，許多膜蛋白，比如電流門控離子通道（VGIC）以及一級和二級活性轉運蛋白，都依賴于跨膜電物理梯度來執行其生物學功能。
不僅留駐在膜的內部或表面之外，膜蛋白與膜之間的互相作用也對細胞壽命形成了深遠的影響。諸如，許多外周膜蛋白定義了細胞器產生的膜輪廓。FoF1ATP合酶的二聚化在打造線粒體中起著重要作用。機械敏感通道通過部份由膜變型施加的機械力控制。
當X射線晶體學是確定結構的主要方式時，解析膜蛋白的結構以前極具挑戰性。必須從斷裂的膜中純化出高度均質的膜蛋白，并用悉心選擇的去污劑替代以結晶。自2013年以來，冷藏電子顯微鏡（cryo-EM）單顆粒剖析（SPA）已成為膜蛋白高幀率結構解析的主流手段。已應用多種試劑將膜蛋白溶化為單個顆粒以進行剖析。不僅去污劑微團外，兩親，納米圓盤和苯乙烯-馬來酸脂類顆粒（SMALP）封閉的帶有天然膜的納米圓盤也已用于成功的膜蛋白冷藏-EM結構剖析。
雖然取得了這種進步，但所有上述膜蛋白分離方式都破壞了膜的拓撲結構，雖然在SMALP環繞的帶有天然膜片的納米盤的情況下，也清除了任何現有的電物理梯度和膜曲率。為了保留那些重要特點，使用電子冷藏斷層掃描（cryo-ET）的原位結構剖析可能是最終的解決方案。但是，當前的技術障礙制止了使用cryo-ET的高幀率原位結構測定。另一種取代策略是研究嵌入脂類體中膜蛋白的結構，該結構已廣泛用于膜蛋白的功能剖析。
雖然使用蛋白脂類體進行了廣泛的功能表征，但僅有有限的嘗試將這些系統用于膜蛋白的結構闡釋。在過去的六年中，早已開發了例如隨機球狀約束（RSC）之類的方式來研究具有改進SPA策略的蛋白脂類體系統。并且，要在兩個報告中執行精確的角度分配或訊號加法，目標蛋白脂類體必須是接近完美的圓球，這是很難獲得的前提條件。兩種方式都還須要對原始圖象進行額外的預處理步驟。
為了將cryo-EM用于嵌入或附著在脂類體上的膜蛋白的結構剖析，有必要為膜蛋白摻入，冷藏樣品制備和cryo-EM數據處理開發高度可重復且便捷的工作流程。因此，研究人員選擇了來自大腸弧菌的經過充分研究的耐多藥轉運蛋白AcrB作為方式開發的原型。質子梯度驅動的AcrB是一種三聚體，分子量約為350kDa。它是雖然在低含量和低含量下也最適于結晶的膜蛋白之一。為此，AcrB的結構是在初期確定的。到目前為止，在蛋白質數據庫（PDB）中使用X射線晶體學和單顆粒冷藏EM方式測定的AcrB結構超過100種細胞膜糖蛋白，為結構驗證提供了極好的參考。
在這項研究中，報告了一種工作流程，該流程具有優化的脂類體分離，高溫樣品制備，深層二維（2D）分類，用于數據處理。使用該研究的簡化方式，獲得了3.9碼率的蛋白脂類體中AcrB的重建。該工作流程可輕松推廣到蛋白脂類體中膜蛋白的結構測定中，并為使用蛋白脂類體系統在受控的電物理勢或膜曲率存在下膜蛋白的結構剖析奠定基礎。
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