紅細胞膜蛋白提取鑒別內容1.紅細胞膜提取2.膜蛋白提取及定量測定（Lowry法）3.膜蛋白電泳分離、分子量測定SDS.鑒別β-actin一.紅細胞膜提取制備（低滲法）原理：RBC置低滲緩沖液(pH7.4)，斷裂溶血－－溶血液。溶血液置高速離心作用中，除去氨水中Hb和其它內含物，制得純凈的RBC膜－－稱為血影“ghost”注意事項：1.離心步驟一定要“平衡、對稱放置”2.溶血液離心后上清汲取留神，以免遺失“膜”3.緩沖液pH7.4，偏酸使Hb殘留降低4.此分離方式適宜于人、大鼠；牛、豬等易使脂蛋白開裂，可避免此種膜的不穩定性。5.本實驗因條件限制，在常溫離心。如需保持蛋白活性細胞膜蛋白，應在4?C離心。（1）RBC分離：15mlRBC液5分鐘RBC（沉淀）＋3倍容積等滲乙酸5分鐘×2瀝干之RBC（2）溶血液制備RBC加入低滲乙酸（>1:50)(在燒瓶中）稍攪拌置冰柜凍格（4?C）溶血過夜（以上步驟已完成！！）二、RBC膜純化（漂洗）三、樣品處理：1.SDS用樣品處理（一大組）：0.3mlRBC面膜+0.3ml樣品溶化液開水浴5’2.Lowry法測定用樣品處理(3-4人/group）：A.取0.3mlRBC面膜＋1.5mlH2O＋150ulNaOH開水浴5’待測管1：取A液0.1ml＋0.9mlH2O待測管2：取A液0.3ml＋0.7mlH2O四、Lowry法測定膜蛋白濃度立刻拌勻細胞膜蛋白，放置15分鐘。
以第６管為空白管，在分光光度計上以620ｎｍ比色，讀取Ａ。以各管標準蛋白含量為橫坐標，各管吸光度值為縱坐標畫圖，畫出標準曲線。2.紅細胞膜樣品蛋白濃度的測定將待測管1、2同上加入酸性銅及酚試劑，一齊測定畫圖：橫座標以標準蛋白濃度縱座標以A620吸光度值圖比列應為3:2（橫：縱）估算：在標準曲線上查出待測樣品的含量，估算提取膜的Prmg數/ml樣品注意稀釋倍數要求：估算原提取RBC液的Pr濃度五、SDS測定膜蛋白分子量不連續電泳系統：電泳緩沖液pH離子硬度與凝膠中不同（濃縮效應）（一）垂直板安裝每套板兩塊玻璃上端對齊，夾好，置于膠架上！（二）凝膠制備（見表）先配好分離膠（留距齒梳1cm），待其融化后，再配濃縮膠。（三）電泳裝置安裝先裝內槽，試無漏水；裝入外槽中，加。上樣品：每孔18ul，2塊/組每塊板留一標準蛋白孔（四）電泳：100V進分離膠調至80V約1.5小時（五）取膠:用專用板平面輕輕“橇”開板，掉入小平皿中。注意：一塊半干轉移（溶入轉移）另一塊考馬斯亮藍染色染色2小時后，7%乙酸脫色（×4）每組做好標記（寫好名子），交生化室掃描或攝像保留。
分子量估算1.檢測：cma.每條帶距離（起始點至帶中心）b.起始至示蹤顏料距離2.MR：條帶距離(a)MR=起始至示蹤顏料距離(b)六、(β-actin鑒別)1.轉膜將與凝膠塊(削去多余部份)通常大小的NC膜、濾紙均浸沒轉移中20分鐘，取出，在半干轉移槽中按以下次序放置：(上）陰極端濾紙-凝膠-膜-濾紙陽極端（下）用玻棒滾動消除空氣氣泡，蓋好上蓋。開啟電源，調電流時間20v，20分鐘2.封閉將膜取出TBST中洗5’，放置于封閉液中10分鐘，用TBST洗5’×3；3.一抗孵育將膜裝入已放一抗堿液塑膠袋中，溫度孵育1小時，用TBST洗5分鐘×3；4.二抗孵育將膜裝入已放二抗堿液的塑膠袋中，溫度孵育1小時，用TBST洗5分鐘×3；5.DAB顯色配制DAB顯色液1ml（適量），取出膜裝入DAB堿液中，顯色（約10分鐘內）；（試劑盒：分餾水1ml，A、B、C各一滴裝入水底）6.結果掃描保存**實驗報告要求：分別按上各點，寫出：原理，操作步驟，結果，討論，推論手寫，A4紙大小，報告首頁寫明實驗者，專業。
實驗分組每位班分三大組，每組十人左右，選出主任實驗進行一大組為單位1.純化RBC膜2.SDS塊膠（一個凝膠架）3.blot4.3-4人一小組測定蛋白質濃度溶血液，用“水泵”吸去上清。！！：膜很輕RBC膜轉至1.5ml塑膠管（2個/大組）5’沉淀（膜）＋低滲乙酸（pH7.4)?ml（吹打）’×4沉淀＋等滲乙酸分鐘沉淀（RBC膜）＋0.6ml等滲（即為RBC面膜）02001501005025含標準蛋白ug３３３３３３酚試劑磨碎，放置１０分鐘１１１１１１酸性銅試劑__0.80.60.40.20.1標準蛋白1.00.20.40.60.80.9H2O(ml)６５４３２１管號試劑1.標準曲線制備8ul8ulTEMED0.06(60ul)0.06（60ul)10％過硝酸銨0.080.110％SDS1.01mol/LTris-HCl2.51.5mol/LTris-HCl4.04.0分餾水1.03.330％凝膠儲備液5％濃縮膠5ml10％分離膠10ml加入過硝酸銨，TEMED即刻灌膠。
ab1410062403024152535405570MR遷移距離cm分子量KD預染標準蛋白3.半對數圖：（六條標準蛋白）（參照統計學散點法）橫座標為遷移率MR縱座標為LogM（直接按每一蛋白分子量標在半對數圖中）4.估算待測樣品蛋白質分子量：選在標準蛋白遷移范圍內的相應待測樣品中的三條帶，檢測距離估算MR，Mw9876543210.10.20.30.4….橫座標為遷移率MR；（六條標準蛋白）縱座標為LogM（直接按每一標準蛋白分子量）2060100