1、實驗4細胞骨架的顯示及觀察實驗4細胞骨架的顯示及觀察姓名：李思露學號：一、實驗目的1.把握用考馬斯亮藍R250染色觀察植物和動物細胞骨架的原理和技巧。2.了解免疫螢光法測量細胞成份的原理和技巧。二、實驗原理1.細胞骨架：指真核細胞中的蛋白纖維網架體系。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質骨架、細胞膜骨架和細胞外基質。狹義的細胞骨架是指細胞質骨架，包括微管（，MT）、微絲（，MF）、中間纖維（，IF）。2.微管微管是細胞內由微管蛋白產生的半徑約的寬度不一的小
2、管。分布在核周圍，呈放射狀向胞質四周擴散，主要確定膜性細胞器的位置和作為膜泡運輸的導管。微管蛋白有和兩種。異二聚體沿橫向聚合成絲，原絲成環狀排列產生微管的壁。微管不穩定，對高溫（冷藏）、高壓等化學誘因及秋水仙素（微管破裂劑）等物理誘因敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚體結合，抑制微管解聚。3.微絲：真核細胞內是主要由肌動蛋白（actin）組成的半徑為57nm的骨架纖絲。主要分布在細胞質膜的外側，作用是確定細胞表面特點、并與細胞運動、收縮、內吞等功能有關。腰部植物肌動蛋白分為、和三種類型，不同種類細胞中肌動蛋白組成不同。肌動蛋白單體為球狀，依次聯接成鏈，兩串肌動蛋白鏈相互纏繞扭曲成一股微絲。細
3、胞松馳素B為微絲破裂劑。4.中間纖維：半徑介于微絲和微管之間（711nm）、由多種不同蛋白組成的細胞骨架成份。在細胞中圍繞著細胞核分布，成束成網，并擴充到細胞質膜，與質膜骨架相聯結。主要起機械支撐和加固作用。組成中間纖維的蛋白：角蛋白，波形蛋白，結蛋白、神經纖維細胞膜骨架，神經膠質纖維和核纖層蛋白。不同組織來源的細胞，組成其中間纖維的蛋白質種類可能不同。5.研究細胞骨架的意義。（1）了解細胞骨架與細胞各類功能行使之間的關系。（2）了解理化誘因是否通過影響細胞骨架對細胞功能形成影響，便于趨利避害。（3）鑒別發育中的細胞及癌癥的來源。6.顯示細胞骨架的常用方式：考馬氏亮藍染色法、免疫螢光染色法、鬼筆
4、環肽標記法。（1）考馬斯亮藍染色法原理及特性原理：用去垢劑X-100處理細胞適合時間，可以溶化膜脂，并與大部份非骨架蛋白疏水區結合而將其溶化，剩下的纖維狀細胞骨架蛋白比較穩定而不被溶化，之后用蛋白顏料考馬斯亮藍染色即可顯示其結構。特征：非特異蛋白染色，不能分辨微管、微絲、中間纖維（2）免疫螢光染色法原理及特性原理：用-100處理固定處理過的細胞，可降低細胞膜私密性，使抗原才能步入細胞內與細胞骨架蛋白結合。接著用螢光素標記的抗骨架蛋白抗原便可通過直接免疫螢光法或間接免疫螢光法顯示骨架。特征：特異顯示各類骨架蛋白（3）鬼筆環肽標記法原理及特性原理：鬼筆環肽可特異性地
5、結合肌動蛋白，為此，用螢光素標記的鬼筆環肽可以顯示微絲。特征：靈敏，能特異顯示微絲。三、實驗材料、試劑及用具（一）材料：菠菜（二）試劑（1）M-緩沖液。（2）6mM乙酸鹽緩沖液（pH6.8）。（3）含1%-100的M-緩沖液。（4）用M-緩沖液配制的3.0%戊二醛。（5）0.2%考馬斯亮藍R250堿液。（6）0.9%硝酸鈉生理鹽水。（三）用具普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡、水浴箱（37）小剪子、鑷子、5mL一次性塑膠注射器、膠頭吸管、1.5mLEP管、1.5mL試管架四、實驗操作考馬斯亮藍染色法顯示大蒜植株內表皮細胞骨架（1）材料打算：撕取黃瓜植株內表皮，裁成大小0
6、.5cm.的小片。（2）PBS平衡：裝入盛有1mL6mmol/L乙酸鹽緩沖液（pH6.8）的EP管中，靜置使材料下沉（完全沾滿）；之后用膠頭滴管吸棄液體。（3）-100處理：加1mL1%-100氨水處理20min，之后用膠頭滴管吸棄液體。（4）漂洗：用M-緩沖液漂洗3次，每次加1.5mL堿液曝曬5min，之后用膠頭滴管吸棄液體。（5）固定：加1mL3.0%戊二醛固定30min,之后用膠頭滴管吸棄液體。（6）漂洗：用PBS漂洗3次，每次曝曬5min,之后用膠頭滴管吸棄液體。（7）染色：用0.51.0mL0.2%考馬斯藍R250堿液染色10min。
7、（8）漂洗：用分餾水漂洗數遍。（9）制備裝片：給載玻片中央加1滴水，用鉗子夾取樣品在其中展開，之后加蓋玻片。（10）顯微觀察：在普通光學顯微鏡下，香菜細胞骨架為遍布細胞的紅色網狀結構。（11）對照樣品：省去步驟（3），不用-100處理；省去步驟（4）,用-100處理后不用M-緩沖液漂洗。五、實驗結果及推論1.實驗樣品圖1香菜花序內表皮細胞骨架（400倍）實驗樣品的細胞骨架分布細密均勻，視野中只剩下細胞骨架的蛋白質，被考馬斯亮藍染成紅色。在視野的上半部份，細胞的背景呈現藍灰色，是因為最后漂洗不徹底所致。2.對照樣品：不用-100處理圖2不用Tr
8、itonX-100處理的蘆筍花序內表皮細胞骨架（400倍）不用-100處理的對照樣品的細胞中不僅細胞骨架還有好多膜泡結構，細胞中還有白色的細胞核。不用-100處理，致使視野中有好多非骨架蛋白，這種非骨架蛋白被考馬斯亮藍染成紅色，影響對細胞骨架的觀察。3.對照樣品：用-100處理后不用M-緩沖液漂洗圖3用-100處理后不用M-緩沖液漂洗的大蒜植株內表皮細胞骨架（400倍）圖3和圖2的情況類似，視野中沒有均勻細密的細胞骨架，這是因為M-緩沖液使細胞骨架中的微絲保持穩定。在M緩沖液中，其中吡啶是緩沖劑，EGTA和EDTA螯合鈣離子，濾液并提供
9、鎂離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態而且較為舒張，以便觀察。用-100處理后即使可以溶化膜脂和非細胞骨架蛋白，并且保留出來的骨架蛋白在沒有M-緩沖液的作用下，其結構仍未能保持穩定，影響觀察結果。六、作業與思索題1.比較用與不用1%-100處理的實驗結果。答：見五、實驗結果與推論部份1、2。2查閱資料說明M-緩沖液中吡啶、MgCl2、EGTA、EDTA、巰基乙酸或二硫蘇糖醇（DTT）在穩定細胞骨架中的作用。答：在M-緩沖液中，吡啶是緩沖劑，MgCl2提供Mg2+,EGTA和EDTA螯合Ca2+，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態而且較為舒張，以便觀察；
10、巰基乙酸或二硫蘇糖醇（DTT）可以在二硫鍵被打開后使蛋白質的四級或五級結構被破壞，因為吲哚乙酸才能打開蛋白質的結構，它經常被用于蛋白質剖析，且硫代乙酸也經常被用于保護蛋白質中自由的半胱絲氨酸羥基之間不會錯誤產生二硫鍵。3.設計測量微絲的間接免疫螢光法實驗流程。（1）用未標記的微絲抗原加到微絲抗體標本上，使抗體抗原充分結合，之后漂洗，去除未結合的抗原。（2）加上螢光標記的抗球蛋白抗原或抗IgG、IgM抗原，標記的抗球蛋白抗原和已結合抗體的抗原進一步結合。（3）立刻用螢光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性螢光硬度，通?？捎谩?”表示：（-）無螢光；（）極弱的可疑螢光；（+）螢光較弱，但清楚可見；（+）螢光明亮；（+-+）螢光閃耀。待檢標本特異性螢光染色硬度達“+”以上，而各類對照顯示為（）或（-），即可判斷為陰性七、反思與改進1.避免香菜植株內表皮蜷曲、折疊細胞膜骨架，若蜷曲折疊可以在漂洗的過程中漸漸展開，沒還展開，在制片時用鉗子當心的將內表皮展開。-100處理時間應足夠，處理完漂洗應充分，否則胞內會存在膜泡狀結構及其它雜蛋白，干擾骨架染色及觀察，盡量保證各組各步處理的時間和方式一致。3.-100處理后各步操作應柔和，防止容器劇烈回落及吸管吹打過猛造成骨架蛋白束破裂。5/55/5