膜蛋白具有多種功能，在細(xì)胞辨識(shí)、細(xì)胞訊號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸?shù)扔兄兄匾慕巧蚨彩墙^佳的抗生素靶向。抽提膜蛋白主要是進(jìn)行蛋白組剖析：常用的實(shí)驗(yàn)是非變性膠電泳、酶活剖析、SDS-PAGE、blot等。本文表述了總蛋白的抽提方式、和膜蛋白的提取方式。
一、從新鮮樣品中提取總蛋白(簡(jiǎn)易法)
1.自配裂解液(pH8.5-9.0)：50mMTris-HCl，2mMEDTA,100mMNaCl，0.5%X-100，調(diào)pH值至8.5-9.0備用;用前加入100μg/ml溶菌酶，1μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液藥量為10-50ml裂解液/1g濕菌體。
2.將40ml菌液在12000g，4℃下離心15分鐘搜集菌體，沉淀用PBS漂浮漂洗2遍，沉淀加入1ml裂解液漂浮菌體。
3.超聲粉碎，采用300w，10s超聲/10s間隔，超聲20min，反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或則變色。
4.1000g離心除去大碎片，上清可直接變性后PAGE電泳檢查，或則用1%SDS堿液透析后凍存。
缺點(diǎn)：結(jié)果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
二、從裂解液中分離總蛋白
1.溶化的樣品碾磨破碎后，加乙酸分層，2-8℃下10000g離心15min，下層水相用于RNA提取，容積約為總體積的60%。
2.用乙酸沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml加入0.3ml無水乙酸混勻，溫度放置3min，2-8℃不超過2000g離心5min。
3.將上清移至新的EP管中，用異戊烷沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml加入1.5ml異戊烷，溫度放置10min，2-8℃下12000g離心10min，棄上清。
4.用富含0.3M硫酸胍的95%乙酸漂洗。每1ml加入2ml洗劑細(xì)胞膜糖蛋白，溫度放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清，重復(fù)漂洗2次。最后加入2ml無水乙酸，渦旋后溫度放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清。
5.冷藏干燥5-10min，1%SDS堿液溶化，反復(fù)吹打，50℃溫浴使其完全溶化，2-8℃下10000g離心10min消除不溶物。
6.取代方案：將3中的酚醇?jí)A液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1%SDS氨水中透析3次，1000g離心10min消除沉淀，上清可直接用于蛋白實(shí)驗(yàn)。
三、從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白(X-114去污劑法)
1.配制疏水性蛋白提取液(非裂解液)：1%X-114，150mMNaCl,10mMTris-HCl，1mMEDTA，調(diào)pH值至8.0備用。
2.菌液于4℃條件下15000g離心15min搜集菌體;用1ml富含5mMMgCl2的PBS漂洗3次，最后于4℃條件下15000g離心15min搜集菌體。
3.菌體沉淀加入1ml冷提取液，于4℃條件下放置2h，17000g離心10min，除去沉淀取上清。
4.將上述上清中的X-114濃度降低到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部份蛋白酶活性細(xì)胞膜糖蛋白，37℃條件下放置10min使其分層。溫度下1000g離心10min使固相和去污相充分分層。
5.將固相和去污相分開，分別用10倍容積的冷乙醇在冰上沉淀45min。
6.于4℃條件下17000g離心30min，用去離子水漂洗沉淀3次。
7.將沉淀溶化在1%SDS氨水中，測(cè)定蛋白含量，比較氣相和去污相中蛋白提取效率，通常是去污相中疏水性膜蛋白較多，易于進(jìn)一步蛋白實(shí)驗(yàn)。
8.SDS-PAGE進(jìn)一步剖析氣相和去污相的蛋白圖譜。
注意事項(xiàng)：膜蛋白的濃度比較少，須要搜集比較多的細(xì)胞，最好是用試劑盒提取膜蛋白如：上海凱基的是試劑盒、膜蛋白提取試劑盒、碧云天膜蛋白提取試劑。