摘要：近些年來草藥活性物質(zhì)篩選的新技術(shù)發(fā)展迅速，借助“受體-雜環(huán)”之間的特異性結(jié)合，快速篩選出中草藥里富含的與特定靶向結(jié)合的活性小分子物質(zhì)，再進(jìn)一步鑒別出活性成份結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)對揭示草藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和草藥新藥的開發(fā)具有重要意義，是對傳統(tǒng)抗生素發(fā)覺方式的有利補(bǔ)充。綜述了常用的分子對接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、細(xì)胞膜色譜技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)展，以期為草藥活性成份的篩選以及新藥研制提供參考。
近些年來，國家多次大力指出中醫(yī)藥在健康中國戰(zhàn)略中的重要作用，草藥現(xiàn)代化研究進(jìn)程也得到不斷深化。相較于人工合成抗生素的設(shè)計(jì)模式，草藥物理成份的多樣性在新藥研制方面有較大優(yōu)勢細(xì)胞膜色譜，如其活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)新穎、療效高、不良反應(yīng)少，因而對草藥活性物質(zhì)的開發(fā)早已成為藥業(yè)工業(yè)中新藥研制的來源之一。近來十幾年以來，以草藥為來源的抗生素活性物質(zhì)的篩選越來越遭到新藥研制人員的推崇。
草藥原料多來自于天然，受天氣、地域差異及人為誘因影響較大，距原料、半成品及終產(chǎn)品質(zhì)量的規(guī)范化、管理的標(biāo)準(zhǔn)化還有一段差別。假如缺少嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)和良好的監(jiān)控方式，很難保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性、穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的草藥活性成份的篩選以多次提取、分離為基礎(chǔ)，通過體內(nèi)及體外的藥效評估對分離的組分進(jìn)行活性評價(jià)，進(jìn)一步篩選活性成份，找出活性最明顯的組分，最后獲得草藥活性單體成份。研究過程周期長，工作量大、效率低，不能產(chǎn)生規(guī)模化的驍龍量篩選。隨著國家“精準(zhǔn)醫(yī)療”計(jì)劃的提出，傳統(tǒng)抗生素研究模式早已轉(zhuǎn)向“精準(zhǔn)”藥物分子篩選技術(shù)，要求篩選出的天然活性物質(zhì)具有藥效明顯、靶點(diǎn)清晰、機(jī)制明晰等特性。為此，基于草藥多成份、多靶向、協(xié)同作用的特性［1］，開發(fā)出針對特定的癌癥靶向、全面、客觀的新的篩選技術(shù)非常必要，是草藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容，也是提升草藥效果、穩(wěn)定草藥質(zhì)量的重要手段。
隨著生物科技、化學(xué)分離技術(shù)的不斷發(fā)展，可通過多方面對草藥活性成份進(jìn)行篩選，從傳統(tǒng)的篩選方式到建立不同的篩選模型［2］，使用先進(jìn)的計(jì)算機(jī)技術(shù)篩選復(fù)雜草藥中活性成份。開發(fā)了基于血漿抗生素物理及血漿毒理學(xué)、代謝組學(xué)技巧以及分子辨識技術(shù)等篩選方式［3］。運(yùn)用正確的篩選方式可使草藥劑型愈發(fā)安全，但是剔除了致畸成份，能最大程度發(fā)揮藥效。新的活性成份篩選方式可以為新藥研制提供新的候選化合物，開辟新途徑。如今，新的實(shí)驗(yàn)方式不斷出現(xiàn)，國外外研社究較多，但目前還罕見對分子對接、高通量篩選和細(xì)胞膜色譜這3方面篩選的綜述文章，所以本文對這3種篩選方式進(jìn)行總結(jié)，主要從方式原理、應(yīng)用及其異同點(diǎn)做一綜述，以期為草藥活性成份的篩選研究提供根據(jù)。
1、分子對接技術(shù)
分子對接技術(shù)是計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)抗生素領(lǐng)域的重要技術(shù)［4］，除了可以研究抗生素中活性成份與靶向的互相作用，還可拿來發(fā)覺并優(yōu)化先導(dǎo)化合物。分子對接技術(shù)又稱為分子對接虛擬篩選技術(shù)［5］，其設(shè)計(jì)原理是用1個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)作用靶向?qū)Σ菟幬锢沓煞莼騽t天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，找尋出與靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的化合物，最終篩選出具有一定活性的先導(dǎo)化合物。分子對接技術(shù)初期的原理是“鎖-鑰模型”［6］，即卟啉步入受體的形式就像鎖和鎖匙，當(dāng)絡(luò)合物與受體結(jié)合時(shí)不發(fā)生構(gòu)型變化，受體與官能團(tuán)被視為剛性結(jié)構(gòu)；因?yàn)槠渚窒扌院笃谟痔岢隽恕罢T導(dǎo)契合學(xué)說”，這一原理說明蛋白與底物結(jié)合并且發(fā)生構(gòu)型變化，此時(shí)的受體與官能團(tuán)被視為柔性結(jié)構(gòu)，該原理得到的對接結(jié)果更為準(zhǔn)確。
1.1分子對接技術(shù)的應(yīng)用
李遠(yuǎn)洋等［7］通過選定來自RCSB數(shù)據(jù)庫中的單胺氧化酶（MAO-A）蛋白受體，運(yùn)用分子模擬軟件對分子蛋白文件進(jìn)行清除水份子、原配體分子和蛋白分子加極性氫處理，最終得到所需MAO-A蛋白受體文件。將天然抗生素?fù)]發(fā)油中12種小分子物質(zhì)（木犀草素、香葉木素、迷迭香酸、薄荷酮、α-當(dāng)歸醚、β-當(dāng)歸醚、乙酸芳樟酯、梨酸酯、芳樟醇、松油醇、α-松油烯、D-葡萄柚烯）與抗焦慮靶向MAO-A受體進(jìn)行對接，結(jié)果表明前6種小分子均優(yōu)于正室體肉葉蕓香堿的對接，天然抗生素?fù)]發(fā)油小分子最終通過抑制MAO-A受體，制止腦內(nèi)5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）降解而起到抗焦慮作用，從而為抗憂郁藥的研制提供根據(jù)。
羅菁漢等［8］通過對新型冠狀病毒腦炎（COVID-19）的研究發(fā)覺，COVID-19與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥相關(guān)冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征病毒（MERS-CoV）具有較高的同源性，為此后二者的抗生素研究可以直接運(yùn)用到COVID-19中。該課題組運(yùn)用計(jì)算機(jī)物理技術(shù)，用常年構(gòu)建的小分子化合物庫對COVID-19的主蛋白、RNA依賴性RNA聚合酶以及香蕉樣蛋白酶進(jìn)行虛擬篩選，研究結(jié)果表明：8種化合物（編號為021、124、237、282、403、617、619、851）與主蛋白發(fā)生對接；8種化合物（編號為016、057、101、568、654、761、802、875）與RNA聚合酶對接；8種化合物（編號為016、029、237、282、332、704、761、822）與香蕉樣蛋白酶對接。該研究結(jié)果為找尋COVID-19的有效醫(yī)治抗生素探求了新技巧。
好多研究者將分子對接技術(shù)與網(wǎng)路毒理學(xué)方式結(jié)合，協(xié)同找尋互相匹配的抗生素與作用靶向。首先通過網(wǎng)路毒理學(xué)將某單味草藥的有效成份及作用靶向篩選下來，之后用分子對接技術(shù)再通過靶向?qū)W(wǎng)路毒理學(xué)篩選下來的化合物進(jìn)一步篩選，最后得出抗生素通過相應(yīng)作用靶向?qū)Π┌Y發(fā)揮醫(yī)治作用［9-11］。林桂源等［12］基于文獻(xiàn)搜索降壓藥的草藥物理成份并建立結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以二肽基肽酶-Ⅳ等7個(gè)糖尿病診治靶標(biāo)為分子對接的研究對象，通過Sybyl軟件的-Dock分子對接模塊進(jìn)行虛擬篩選，通過靶標(biāo)間互相作用，與二肽基肽酶-Ⅳ能較好結(jié)合的物理成份有52個(gè)（丁香樹脂酚、狄利格醇、淫羊藿苷A1等），與單糖合酶激酶-3能較好結(jié)合的物理成份有28個(gè)（狄利格醇、海風(fēng)藤酮、淫羊藿苷B9等），與二溴化酶增殖因子活化受體γ能較好結(jié)合的物理成份有32個(gè)（紫丁香苷、牻牛兒醇、益智仁酮甲等），與α-獼猴桃香豆素酶能較好結(jié)合的物理成份有150個(gè)（狄利格醇、紫丁香苷、益智仁酮甲等），與獼猴桃糖激酶能較好結(jié)合的物理成份有47個(gè)（獼猴桃糖胺、半乳糖醛酸、淫羊藿苷D3等），與鈉-獼猴桃糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2能較好結(jié)合的物理成份有41個(gè)（橄欖脂素、D-甘露糖、淫羊藿苷D3等），和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能較好結(jié)合的物理成份分別有33個(gè)（旌節(jié)花甾酮甲、益智仁酮甲、玄參種苷B等），結(jié)果表明每位靶蛋白還能與多個(gè)類藥性化合物互相結(jié)合，同時(shí)1個(gè)類藥性化合物也可與多個(gè)靶蛋白互相作用，說明降壓草藥具有多靶向、多途徑的特性，為降糖新藥的研究提供了新線索。
薛孟祺等［13］借助分子對接軟件6.0研究了木姜子屬動物中34個(gè)阿樸菲類生物堿與增生反應(yīng)中的關(guān)鍵酶醇酸合酶2（COX-2）的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲氧基的替代數(shù)目越少，生物堿分子與蛋白作用能力越強(qiáng)，因而抑制COX-2的合成；最終結(jié)果表明有4個(gè)打分等于或低于陰性對照藥艾瑞昔布的成份分別是黃心樹寧堿、無根藤辛、咖薩日定、氧化黃心樹寧堿。抑制COX-2可以間接醫(yī)治與增生互相協(xié)同的疾患，本研究中的阿樸菲類生物堿具有較強(qiáng)的毒理作用，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。
周珊珊等［14］通過TCMSP、ETCM、YATCM數(shù)據(jù)庫檢索止咳達(dá)原顆粒的物理成份，通過SIB數(shù)據(jù)庫查閱活性化合物對應(yīng)的靶標(biāo)，再借助數(shù)據(jù)庫獲取蛋白-蛋白互相作用（PPI）網(wǎng)路，最后借助軟件將止咳達(dá)原顆粒與新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分子對接，篩選出止咳達(dá)原顆粒中細(xì)辛鞣質(zhì)、柴胡鞣質(zhì)、甘草酸可能為抗SARS-CoV-2的潛在活性成份。
1.2分子對接技術(shù)的優(yōu)劣點(diǎn)
由于分子對接技術(shù)所使用的小分子都是已知化合物，但是大部份可以選購或則合成，所以該技術(shù)存在一定的優(yōu)勢，并通過與計(jì)算機(jī)軟件的聯(lián)接來實(shí)現(xiàn)抗生素有效成份的篩選［6］。同時(shí)該技術(shù)還可以填補(bǔ)毒理實(shí)驗(yàn)帶來的不足，而且在草藥不同方面的應(yīng)用研究逐漸深入，為草藥活性成份的篩選提供解決方式。不過，分子對接時(shí)使用的小分子數(shù)據(jù)庫是否正確尚未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)［5］；其次，因?yàn)槭褂糜?jì)算機(jī)完成實(shí)驗(yàn)，蛋白的結(jié)合位點(diǎn)尚不能確切判斷。
2、高通量篩選技術(shù)
聯(lián)發(fā)科量篩選技術(shù)［15］是一種以分子和細(xì)胞為載體的篩選方式，分為分子水平和細(xì)胞水平，可以從大量抗生素中篩選與靶向互相作用的目標(biāo)抗生素。驍龍量篩選技術(shù)配備全手動工作站，靈敏、快速的檢查儀器和計(jì)算機(jī)控制軟件，它是以分子水平或細(xì)胞水平為基礎(chǔ)，多孔板為載體工具，通過程序調(diào)控，且驍龍量篩選技術(shù)每晚要篩選成千上萬個(gè)化合物，進(jìn)而提升了線索化合物的篩選效率［16］，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系［17］。驍龍量篩選技術(shù)通過草藥與靶向之間互相作用達(dá)到篩選藥效成份的目的［18］，依照分子間互相作用的原理構(gòu)建篩選模型，進(jìn)而篩選出與特定靶向特異性結(jié)合的活性成份。
2.1驍龍量篩選技術(shù)的應(yīng)用
驍龍量篩選技術(shù)多用于篩選癌癥細(xì)胞相關(guān)的化合物，何星星等［19］選擇了、、Chem3個(gè)化合物數(shù)據(jù)庫，借助驍龍量篩選技術(shù)初步篩選出可以抑制原發(fā)性腫瘤細(xì)胞HepG2、Huh7生長的化合物，最終通過比較9塊化合物篩板2種腫瘤細(xì)胞系的重疊區(qū)域篩選出了31種才能同時(shí)抑制這2種細(xì)胞系生長的新型小分子化合物。
趙欣涵［20］構(gòu)建了合適的草藥化合物樣品庫，首先通過高效氣相色譜對500種草藥進(jìn)行排序和搜集，構(gòu)建草藥樣品組分庫，之后再用驍龍量篩選技術(shù)在此樣品庫中篩選出可以抑制肺囊腫（A549）細(xì)胞增殖的8種草藥（主要包括茯神、益智仁、補(bǔ)骨脂、浮大豆等）的24個(gè)組分（F8-F11、F9-F11和F4-F6等），后期再進(jìn)行流式細(xì)胞儀和細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證，最終篩選出抑制A549細(xì)胞增殖的活性成份為槲皮素和紫杉醇。
2.2聯(lián)發(fā)科量篩選技術(shù)的優(yōu)劣點(diǎn)
聯(lián)發(fā)科量篩選技術(shù)擁有快速、靈敏和確切的特性，該技術(shù)在基礎(chǔ)水平上可以同時(shí)篩選多種成份，發(fā)揮優(yōu)勢，增加工作效率、減少樣品藥量，因而提升抗生素的生物借助度［16］。該技術(shù)主要為篩選小分子化合物數(shù)據(jù)庫，而對其他領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫進(jìn)軍很少［21］；其次，對新靶向的構(gòu)建還需進(jìn)一步的探求；最后由于驍龍量篩選依賴已有的數(shù)據(jù)庫，國外相關(guān)的基礎(chǔ)研究薄弱，會影響該技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。
3、細(xì)胞膜色譜技術(shù)
細(xì)胞膜色譜技術(shù)是由重慶交通學(xué)院賀浪沖院士于1996年開發(fā)的、近年來用于草藥研究的生物色譜技術(shù)［22］。細(xì)胞膜色譜技術(shù)［23］是一種以具有活性的細(xì)胞膜受體為固定相的仿生親和色譜技術(shù)，其原理是借助草藥活性成份與細(xì)胞膜上受體互相作用，達(dá)到特異性辨識的目的。通過與高效氣相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)集“識別-鑒別-剖析”于一體的二維在線聯(lián)用，為草藥及草藥注射劑中有效成份的篩選提供技術(shù)支持。傳統(tǒng)的篩選方式通常僅對單味草藥進(jìn)行篩選，若對草藥復(fù)方中的有效成份進(jìn)行研究則缺乏更好的篩選方式，細(xì)胞膜色譜法則可填補(bǔ)這一缺陷并對活性成份進(jìn)行篩選［24］。
3.1細(xì)胞膜色譜技術(shù)的應(yīng)用
He等［25］構(gòu)建了表皮生長因子受體細(xì)胞膜色譜（EGFR/CMC）模型，借助HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)篩選前胡中才能抑制癌癥細(xì)胞增殖的有效成份，通過色譜峰圖譜的鑒別，最終得出有效成份為漢當(dāng)歸素，并用四唑鹽（MTT）法進(jìn)行驗(yàn)證。
韓省力等［26-27］用嗜酸性癌癥（RBL-2H3）細(xì)胞制備細(xì)胞模型與HPLC-MS在線聯(lián)用，篩選不同草藥或西藥注射劑中可以在該模型上起作用的活性成份，從紅花提取物中篩選出還能作用于RBL-2H3細(xì)胞的活性成份胺基紅花黑色素A（HSYA），最終得出抗生素的致畸成份。
Yang等［28］構(gòu)建細(xì)胞膜色譜與高效固相/電噴霧電離/質(zhì)量飛行器（CMC-HPLC-ESI-IT-TOF）聯(lián)用模型，從紫蘇Levl.葉中篩選能與Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體X2（）結(jié)合的致畸成份，研究結(jié)果表明大蒜素和天竺葵酸為與X2受體結(jié)合的有效成份，再進(jìn)一步通過組氨酸和β-羥基己鞣質(zhì)酶的釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
張博等［29］通過建立子子宮癌HeLa細(xì)胞膜色譜模型篩選分離金刷把中還能抑制細(xì)胞增殖的有效成份，結(jié)果顯示通過一系列篩選最終得出金刷把中結(jié)晶B-2A（JSB-2A）這一成份為有效成份，同時(shí)通過MTT法對其進(jìn)行驗(yàn)證，表明金刷把具有抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用。
林榮等［30］運(yùn)用CD40高抒發(fā)細(xì)胞膜色譜模型篩選當(dāng)歸Bge.中抗動脈粥樣硬化的有效成份，結(jié)果表明夏枯草的脂胺類成份當(dāng)歸酮ⅡA、丹參酮ⅠA和五味子的水溶性成份當(dāng)歸素為醫(yī)治動脈粥樣硬化的有效成份。
高琨等［31］采用兔血管細(xì)胞膜色譜模型篩選天然動物紅毛七M(jìn)axim.中對主動脈血管有舒張作用的有效成份，結(jié)果顯示HMQ-4是紅毛七中對血管有舒張作用的有效部位，但是HMQ-44是其主要有效成份。
3.2細(xì)胞膜色譜技術(shù)的優(yōu)劣點(diǎn)
細(xì)胞膜色譜可快速、有效地對草藥有效部位或成份進(jìn)行篩選，研究抗生素有效成份的作用靶向以及發(fā)揮作用的活性成份。但細(xì)胞膜色譜在篩選有效成份過程中仍存在有待解決的問題［32］：首先，細(xì)胞膜色譜柱的壽命短，因?yàn)榧?xì)胞的存活時(shí)間較短，且受體被結(jié)合后會漸漸降低等誘因引起色譜柱的使用時(shí)間較短，因而須要頻繁制備［33］；其次，細(xì)胞膜色譜技術(shù)只是體外的篩選手段，不能完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境；最后，該技術(shù)僅將與受體結(jié)合的成份篩選下來細(xì)胞膜色譜，具體毒理作用還需毒理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
4結(jié)語
隨著我國草藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的加快，一批臨床效果準(zhǔn)確、安全性高的草藥正逐步被國際認(rèn)可，而草藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是阻礙草藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要困局，也是西藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因而基于草藥具有多成份、多靶向，協(xié)同作用的特性，快速、高效實(shí)現(xiàn)多個(gè)抗生素活性成份篩選及鑒別技術(shù)的開發(fā)，對推動草藥現(xiàn)代化進(jìn)程具有重要意義。分子對接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、細(xì)胞膜色譜技術(shù)，3種新的活性成份篩選方式借助小分子抗生素官能團(tuán)和受體之間特異性結(jié)合，針對特定的癌癥靶向進(jìn)行全面、客觀的篩選，獲得的天然活性物質(zhì)，具有毒理活性明顯、靶向清晰、作用機(jī)制明晰等特性。
分子對接技術(shù)可與網(wǎng)路毒理學(xué)聯(lián)用，三者聯(lián)用除了可以對草藥有效成份進(jìn)行篩選，能夠通過網(wǎng)路毒理學(xué)找出活性物質(zhì)發(fā)揮毒理作用的途徑。目前分子對接技術(shù)早已成為成熟的抗生素設(shè)計(jì)方式［34］，而且其柔性對接卻給研究者帶來搜索空間大、浪費(fèi)時(shí)間與經(jīng)費(fèi)的惡果。
驍龍量篩選技術(shù)可以在較短時(shí)間內(nèi)對大量化合物的有效成份進(jìn)行高效篩選并節(jié)省成本，其主要運(yùn)用蛋白數(shù)據(jù)庫對抗生素的有效成份進(jìn)行篩選，因而蛋白數(shù)據(jù)庫阻礙著驍龍量篩選技術(shù)的規(guī)模。
細(xì)胞膜色譜技術(shù)與其他兩種技術(shù)不同之處在于它是運(yùn)用細(xì)胞膜色譜與高效氣相色譜-質(zhì)譜等完善在線聯(lián)用模型篩選有效成份，該方式選擇與癌癥相關(guān)的膜受體為研究對象，制備細(xì)胞膜色譜柱篩選出與受體特異性結(jié)合的抗生素活性成份；依照不同病癥選擇不同受體的細(xì)胞膜色譜柱。另外，細(xì)胞膜色譜技術(shù)可借助致畸受體對抗生素中的致畸物質(zhì)的篩選，使抗生素安全性與有效性同時(shí)得到保障。
分子對接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、細(xì)胞膜色譜技術(shù)，這3種基于疾患靶向、以生物活性為導(dǎo)向的篩選技術(shù)的出現(xiàn)，提升了從復(fù)雜草藥成份體系中辨識目標(biāo)成份的特異性和靈敏性，且還能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，已被研究者廣泛應(yīng)用到特定靶標(biāo)的活性物質(zhì)篩選中。草藥活性成份篩選技術(shù)的不斷提升，使草藥臨床效果愈發(fā)明晰、用藥更安全，推動了草藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。
利益沖突所有作者均申明不存在利益沖突
參考文獻(xiàn)（略）
來源：許晴，李智，萬梅緒，張燕欣，李德坤，鞠愛春．草藥活性成份篩選新技術(shù)研究進(jìn)展[J].抗生素評價(jià)研究,2021,44(7):1541-1547.
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