摘要：近些年來草藥活性物質(zhì)篩選的新技術(shù)發(fā)展迅速，借助“受體-雜環(huán)”之間的特異性結(jié)合，快速篩選出中草藥里富含的與特定靶向結(jié)合的活性小分子物質(zhì)，再進一步鑒別出活性成份結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)對揭示草藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和草藥新藥的開發(fā)具有重要意義，是對傳統(tǒng)抗生素發(fā)覺方式的有利補充。綜述了常用的分子對接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、細胞膜色譜技術(shù)的原理、特點及應(yīng)用進展，以期為草藥活性成份的篩選以及新藥研制提供參考。
近些年來，國家多次大力指出中醫(yī)藥在健康中國戰(zhàn)略中的重要作用，草藥現(xiàn)代化研究進程也得到不斷深化。相較于人工合成抗生素的設(shè)計模式，草藥物理成份的多樣性在新藥研制方面有較大優(yōu)勢細胞膜色譜，如其活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)新穎、療效高、不良反應(yīng)少，因而對草藥活性物質(zhì)的開發(fā)早已成為藥業(yè)工業(yè)中新藥研制的來源之一。近來十幾年以來，以草藥為來源的抗生素活性物質(zhì)的篩選越來越遭到新藥研制人員的推崇。
草藥原料多來自于天然，受天氣、地域差異及人為誘因影響較大，距原料、半成品及終產(chǎn)品質(zhì)量的規(guī)范化、管理的標(biāo)準(zhǔn)化還有一段差別。假如缺少嚴格的質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)和良好的監(jiān)控方式，很難保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性、穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的草藥活性成份的篩選以多次提取、分離為基礎(chǔ)，通過體內(nèi)及體外的藥效評估對分離的組分進行活性評價，進一步篩選活性成份，找出活性最明顯的組分，最后獲得草藥活性單體成份。研究過程周期長，工作量大、效率低，不能產(chǎn)生規(guī)模化的驍龍量篩選。隨著國家“精準(zhǔn)醫(yī)療”計劃的提出，傳統(tǒng)抗生素研究模式早已轉(zhuǎn)向“精準(zhǔn)”藥物分子篩選技術(shù)，要求篩選出的天然活性物質(zhì)具有藥效明顯、靶點清晰、機制明晰等特性。為此，基于草藥多成份、多靶向、協(xié)同作用的特性［1］，開發(fā)出針對特定的癌癥靶向、全面、客觀的新的篩選技術(shù)非常必要，是草藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容，也是提升草藥效果、穩(wěn)定草藥質(zhì)量的重要手段。
隨著生物科技、化學(xué)分離技術(shù)的不斷發(fā)展，可通過多方面對草藥活性成份進行篩選，從傳統(tǒng)的篩選方式到建立不同的篩選模型［2］，使用先進的計算機技術(shù)篩選復(fù)雜草藥中活性成份。開發(fā)了基于血漿抗生素物理及血漿毒理學(xué)、代謝組學(xué)技巧以及分子辨識技術(shù)等篩選方式［3］。運用正確的篩選方式可使草藥劑型愈發(fā)安全，但是剔除了致畸成份，能最大程度發(fā)揮藥效。新的活性成份篩選方式可以為新藥研制提供新的候選化合物，開辟新途徑。如今，新的實驗方式不斷出現(xiàn)，國外外研社究較多，但目前還罕見對分子對接、高通量篩選和細胞膜色譜這3方面篩選的綜述文章，所以本文對這3種篩選方式進行總結(jié)，主要從方式原理、應(yīng)用及其異同點做一綜述，以期為草藥活性成份的篩選研究提供根據(jù)。
1、分子對接技術(shù)
分子對接技術(shù)是計算機輔助設(shè)計抗生素領(lǐng)域的重要技術(shù)［4］，除了可以研究抗生素中活性成份與靶向的互相作用，還可拿來發(fā)覺并優(yōu)化先導(dǎo)化合物。分子對接技術(shù)又稱為分子對接虛擬篩選技術(shù)［5］，其設(shè)計原理是用1個或多個蛋白質(zhì)作用靶向?qū)Σ菟幬锢沓煞莼騽t天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進行篩選，找尋出與靶標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的化合物，最終篩選出具有一定活性的先導(dǎo)化合物。分子對接技術(shù)初期的原理是“鎖-鑰模型”［6］，即卟啉步入受體的形式就像鎖和鎖匙，當(dāng)絡(luò)合物與受體結(jié)合時不發(fā)生構(gòu)型變化，受體與官能團被視為剛性結(jié)構(gòu)；因為其局限性后期又提出了“誘導(dǎo)契合學(xué)說”，這一原理說明蛋白與底物結(jié)合并且發(fā)生構(gòu)型變化，此時的受體與官能團被視為柔性結(jié)構(gòu)，該原理得到的對接結(jié)果更為準(zhǔn)確。
1.1分子對接技術(shù)的應(yīng)用
李遠洋等［7］通過選定來自RCSB數(shù)據(jù)庫中的單胺氧化酶（MAO-A）蛋白受體，運用分子模擬軟件對分子蛋白文件進行清除水份子、原配體分子和蛋白分子加極性氫處理，最終得到所需MAO-A蛋白受體文件。將天然抗生素揮發(fā)油中12種小分子物質(zhì)（木犀草素、香葉木素、迷迭香酸、薄荷酮、α-當(dāng)歸醚、β-當(dāng)歸醚、乙酸芳樟酯、梨酸酯、芳樟醇、松油醇、α-松油烯、D-葡萄柚烯）與抗焦慮靶向MAO-A受體進行對接，結(jié)果表明前6種小分子均優(yōu)于正室體肉葉蕓香堿的對接，天然抗生素揮發(fā)油小分子最終通過抑制MAO-A受體，制止腦內(nèi)5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）降解而起到抗焦慮作用，從而為抗憂郁藥的研制提供根據(jù)。
羅菁漢等［8］通過對新型冠狀病毒腦炎（COVID-19）的研究發(fā)覺，COVID-19與嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥相關(guān)冠狀病毒（SARS-CoV）和中東呼吸綜合征病毒（MERS-CoV）具有較高的同源性，為此后二者的抗生素研究可以直接運用到COVID-19中。該課題組運用計算機物理技術(shù)，用常年構(gòu)建的小分子化合物庫對COVID-19的主蛋白、RNA依賴性RNA聚合酶以及香蕉樣蛋白酶進行虛擬篩選，研究結(jié)果表明：8種化合物（編號為021、124、237、282、403、617、619、851）與主蛋白發(fā)生對接；8種化合物（編號為016、057、101、568、654、761、802、875）與RNA聚合酶對接；8種化合物（編號為016、029、237、282、332、704、761、822）與香蕉樣蛋白酶對接。該研究結(jié)果為找尋COVID-19的有效醫(yī)治抗生素探求了新技巧。
好多研究者將分子對接技術(shù)與網(wǎng)路毒理學(xué)方式結(jié)合，協(xié)同找尋互相匹配的抗生素與作用靶向。首先通過網(wǎng)路毒理學(xué)將某單味草藥的有效成份及作用靶向篩選下來，之后用分子對接技術(shù)再通過靶向?qū)W(wǎng)路毒理學(xué)篩選下來的化合物進一步篩選，最后得出抗生素通過相應(yīng)作用靶向?qū)Π┌Y發(fā)揮醫(yī)治作用［9-11］。林桂源等［12］基于文獻搜索降壓藥的草藥物理成份并建立結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以二肽基肽酶-Ⅳ等7個糖尿病診治靶標(biāo)為分子對接的研究對象，通過Sybyl軟件的-Dock分子對接模塊進行虛擬篩選，通過靶標(biāo)間互相作用，與二肽基肽酶-Ⅳ能較好結(jié)合的物理成份有52個（丁香樹脂酚、狄利格醇、淫羊藿苷A1等），與單糖合酶激酶-3能較好結(jié)合的物理成份有28個（狄利格醇、海風(fēng)藤酮、淫羊藿苷B9等），與二溴化酶增殖因子活化受體γ能較好結(jié)合的物理成份有32個（紫丁香苷、牻牛兒醇、益智仁酮甲等），與α-獼猴桃香豆素酶能較好結(jié)合的物理成份有150個（狄利格醇、紫丁香苷、益智仁酮甲等），與獼猴桃糖激酶能較好結(jié)合的物理成份有47個（獼猴桃糖胺、半乳糖醛酸、淫羊藿苷D3等），與鈉-獼猴桃糖共轉(zhuǎn)運蛋白2能較好結(jié)合的物理成份有41個（橄欖脂素、D-甘露糖、淫羊藿苷D3等），和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能較好結(jié)合的物理成份分別有33個（旌節(jié)花甾酮甲、益智仁酮甲、玄參種苷B等），結(jié)果表明每位靶蛋白還能與多個類藥性化合物互相結(jié)合，同時1個類藥性化合物也可與多個靶蛋白互相作用，說明降壓草藥具有多靶向、多途徑的特性，為降糖新藥的研究提供了新線索。
薛孟祺等［13］借助分子對接軟件6.0研究了木姜子屬動物中34個阿樸菲類生物堿與增生反應(yīng)中的關(guān)鍵酶醇酸合酶2（COX-2）的抑制作用，實驗結(jié)果表明甲氧基的替代數(shù)目越少，生物堿分子與蛋白作用能力越強，因而抑制COX-2的合成；最終結(jié)果表明有4個打分等于或低于陰性對照藥艾瑞昔布的成份分別是黃心樹寧堿、無根藤辛、咖薩日定、氧化黃心樹寧堿。抑制COX-2可以間接醫(yī)治與增生互相協(xié)同的疾患，本研究中的阿樸菲類生物堿具有較強的毒理作用，具有進一步開發(fā)的潛力。
周珊珊等［14］通過TCMSP、ETCM、YATCM數(shù)據(jù)庫檢索止咳達原顆粒的物理成份，通過SIB數(shù)據(jù)庫查閱活性化合物對應(yīng)的靶標(biāo)，再借助數(shù)據(jù)庫獲取蛋白-蛋白互相作用（PPI）網(wǎng)路，最后借助軟件將止咳達原顆粒與新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行分子對接，篩選出止咳達原顆粒中細辛鞣質(zhì)、柴胡鞣質(zhì)、甘草酸可能為抗SARS-CoV-2的潛在活性成份。
1.2分子對接技術(shù)的優(yōu)劣點
由于分子對接技術(shù)所使用的小分子都是已知化合物，但是大部份可以選購或則合成，所以該技術(shù)存在一定的優(yōu)勢，并通過與計算機軟件的聯(lián)接來實現(xiàn)抗生素有效成份的篩選［6］。同時該技術(shù)還可以填補毒理實驗帶來的不足，而且在草藥不同方面的應(yīng)用研究逐漸深入，為草藥活性成份的篩選提供解決方式。不過，分子對接時使用的小分子數(shù)據(jù)庫是否正確尚未有文獻報導(dǎo)［5］；其次，因為使用計算機完成實驗，蛋白的結(jié)合位點尚不能確切判斷。
2、高通量篩選技術(shù)
聯(lián)發(fā)科量篩選技術(shù)［15］是一種以分子和細胞為載體的篩選方式，分為分子水平和細胞水平，可以從大量抗生素中篩選與靶向互相作用的目標(biāo)抗生素。驍龍量篩選技術(shù)配備全手動工作站，靈敏、快速的檢查儀器和計算機控制軟件，它是以分子水平或細胞水平為基礎(chǔ)，多孔板為載體工具，通過程序調(diào)控，且驍龍量篩選技術(shù)每晚要篩選成千上萬個化合物，進而提升了線索化合物的篩選效率［16］，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)支持整體運轉(zhuǎn)的技術(shù)體系［17］。驍龍量篩選技術(shù)通過草藥與靶向之間互相作用達到篩選藥效成份的目的［18］，依照分子間互相作用的原理構(gòu)建篩選模型，進而篩選出與特定靶向特異性結(jié)合的活性成份。
2.1驍龍量篩選技術(shù)的應(yīng)用
驍龍量篩選技術(shù)多用于篩選癌癥細胞相關(guān)的化合物，何星星等［19］選擇了、、Chem3個化合物數(shù)據(jù)庫，借助驍龍量篩選技術(shù)初步篩選出可以抑制原發(fā)性腫瘤細胞HepG2、Huh7生長的化合物，最終通過比較9塊化合物篩板2種腫瘤細胞系的重疊區(qū)域篩選出了31種才能同時抑制這2種細胞系生長的新型小分子化合物。
趙欣涵［20］構(gòu)建了合適的草藥化合物樣品庫，首先通過高效氣相色譜對500種草藥進行排序和搜集，構(gòu)建草藥樣品組分庫，之后再用驍龍量篩選技術(shù)在此樣品庫中篩選出可以抑制肺囊腫（A549）細胞增殖的8種草藥（主要包括茯神、益智仁、補骨脂、浮大豆等）的24個組分（F8-F11、F9-F11和F4-F6等），后期再進行流式細胞儀和細胞自噬實驗對其進行驗證，最終篩選出抑制A549細胞增殖的活性成份為槲皮素和紫杉醇。
2.2聯(lián)發(fā)科量篩選技術(shù)的優(yōu)劣點
聯(lián)發(fā)科量篩選技術(shù)擁有快速、靈敏和確切的特性，該技術(shù)在基礎(chǔ)水平上可以同時篩選多種成份，發(fā)揮優(yōu)勢，增加工作效率、減少樣品藥量，因而提升抗生素的生物借助度［16］。該技術(shù)主要為篩選小分子化合物數(shù)據(jù)庫，而對其他領(lǐng)域的數(shù)據(jù)庫進軍很少［21］；其次，對新靶向的構(gòu)建還需進一步的探求；最后由于驍龍量篩選依賴已有的數(shù)據(jù)庫，國外相關(guān)的基礎(chǔ)研究薄弱，會影響該技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。
3、細胞膜色譜技術(shù)
細胞膜色譜技術(shù)是由重慶交通學(xué)院賀浪沖院士于1996年開發(fā)的、近年來用于草藥研究的生物色譜技術(shù)［22］。細胞膜色譜技術(shù)［23］是一種以具有活性的細胞膜受體為固定相的仿生親和色譜技術(shù)，其原理是借助草藥活性成份與細胞膜上受體互相作用，達到特異性辨識的目的。通過與高效氣相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）聯(lián)用，實現(xiàn)集“識別-鑒別-剖析”于一體的二維在線聯(lián)用，為草藥及草藥注射劑中有效成份的篩選提供技術(shù)支持。傳統(tǒng)的篩選方式通常僅對單味草藥進行篩選，若對草藥復(fù)方中的有效成份進行研究則缺乏更好的篩選方式，細胞膜色譜法則可填補這一缺陷并對活性成份進行篩選［24］。
3.1細胞膜色譜技術(shù)的應(yīng)用
He等［25］構(gòu)建了表皮生長因子受體細胞膜色譜（EGFR/CMC）模型，借助HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)篩選前胡中才能抑制癌癥細胞增殖的有效成份，通過色譜峰圖譜的鑒別，最終得出有效成份為漢當(dāng)歸素，并用四唑鹽（MTT）法進行驗證。
韓省力等［26-27］用嗜酸性癌癥（RBL-2H3）細胞制備細胞模型與HPLC-MS在線聯(lián)用，篩選不同草藥或西藥注射劑中可以在該模型上起作用的活性成份，從紅花提取物中篩選出還能作用于RBL-2H3細胞的活性成份胺基紅花黑色素A（HSYA），最終得出抗生素的致畸成份。
Yang等［28］構(gòu)建細胞膜色譜與高效固相/電噴霧電離/質(zhì)量飛行器（CMC-HPLC-ESI-IT-TOF）聯(lián)用模型，從紫蘇Levl.葉中篩選能與Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體X2（）結(jié)合的致畸成份，研究結(jié)果表明大蒜素和天竺葵酸為與X2受體結(jié)合的有效成份，再進一步通過組氨酸和β-羥基己鞣質(zhì)酶的釋放實驗進行驗證。
張博等［29］通過建立子子宮癌HeLa細胞膜色譜模型篩選分離金刷把中還能抑制細胞增殖的有效成份，結(jié)果顯示通過一系列篩選最終得出金刷把中結(jié)晶B-2A（JSB-2A）這一成份為有效成份，同時通過MTT法對其進行驗證，表明金刷把具有抑制HeLa細胞增殖的作用。
林榮等［30］運用CD40高抒發(fā)細胞膜色譜模型篩選當(dāng)歸Bge.中抗動脈粥樣硬化的有效成份，結(jié)果表明夏枯草的脂胺類成份當(dāng)歸酮ⅡA、丹參酮ⅠA和五味子的水溶性成份當(dāng)歸素為醫(yī)治動脈粥樣硬化的有效成份。
高琨等［31］采用兔血管細胞膜色譜模型篩選天然動物紅毛七Maxim.中對主動脈血管有舒張作用的有效成份，結(jié)果顯示HMQ-4是紅毛七中對血管有舒張作用的有效部位，但是HMQ-44是其主要有效成份。
3.2細胞膜色譜技術(shù)的優(yōu)劣點
細胞膜色譜可快速、有效地對草藥有效部位或成份進行篩選，研究抗生素有效成份的作用靶向以及發(fā)揮作用的活性成份。但細胞膜色譜在篩選有效成份過程中仍存在有待解決的問題［32］：首先，細胞膜色譜柱的壽命短，因為細胞的存活時間較短，且受體被結(jié)合后會漸漸降低等誘因引起色譜柱的使用時間較短，因而須要頻繁制備［33］；其次，細胞膜色譜技術(shù)只是體外的篩選手段，不能完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境；最后，該技術(shù)僅將與受體結(jié)合的成份篩選下來細胞膜色譜，具體毒理作用還需毒理實驗進一步驗證。
4結(jié)語
隨著我國草藥現(xiàn)代化戰(zhàn)略的加快，一批臨床效果準(zhǔn)確、安全性高的草藥正逐步被國際認可，而草藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是阻礙草藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要困局，也是西藥研究領(lǐng)域的熱點和難點，因而基于草藥具有多成份、多靶向，協(xié)同作用的特性，快速、高效實現(xiàn)多個抗生素活性成份篩選及鑒別技術(shù)的開發(fā)，對推動草藥現(xiàn)代化進程具有重要意義。分子對接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、細胞膜色譜技術(shù)，3種新的活性成份篩選方式借助小分子抗生素官能團和受體之間特異性結(jié)合，針對特定的癌癥靶向進行全面、客觀的篩選，獲得的天然活性物質(zhì)，具有毒理活性明顯、靶向清晰、作用機制明晰等特性。
分子對接技術(shù)可與網(wǎng)路毒理學(xué)聯(lián)用，三者聯(lián)用除了可以對草藥有效成份進行篩選，能夠通過網(wǎng)路毒理學(xué)找出活性物質(zhì)發(fā)揮毒理作用的途徑。目前分子對接技術(shù)早已成為成熟的抗生素設(shè)計方式［34］，而且其柔性對接卻給研究者帶來搜索空間大、浪費時間與經(jīng)費的惡果。
驍龍量篩選技術(shù)可以在較短時間內(nèi)對大量化合物的有效成份進行高效篩選并節(jié)省成本，其主要運用蛋白數(shù)據(jù)庫對抗生素的有效成份進行篩選，因而蛋白數(shù)據(jù)庫阻礙著驍龍量篩選技術(shù)的規(guī)模。
細胞膜色譜技術(shù)與其他兩種技術(shù)不同之處在于它是運用細胞膜色譜與高效氣相色譜-質(zhì)譜等完善在線聯(lián)用模型篩選有效成份，該方式選擇與癌癥相關(guān)的膜受體為研究對象，制備細胞膜色譜柱篩選出與受體特異性結(jié)合的抗生素活性成份；依照不同病癥選擇不同受體的細胞膜色譜柱。另外，細胞膜色譜技術(shù)可借助致畸受體對抗生素中的致畸物質(zhì)的篩選，使抗生素安全性與有效性同時得到保障。
分子對接技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、細胞膜色譜技術(shù)，這3種基于疾患靶向、以生物活性為導(dǎo)向的篩選技術(shù)的出現(xiàn)，提升了從復(fù)雜草藥成份體系中辨識目標(biāo)成份的特異性和靈敏性，且還能實現(xiàn)大規(guī)模、高通量篩選，已被研究者廣泛應(yīng)用到特定靶標(biāo)的活性物質(zhì)篩選中。草藥活性成份篩選技術(shù)的不斷提升，使草藥臨床效果愈發(fā)明晰、用藥更安全，推動了草藥的現(xiàn)代化進程。
利益沖突所有作者均申明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來源：許晴，李智，萬梅緒，張燕欣，李德坤，鞠愛春．草藥活性成份篩選新技術(shù)研究進展[J].抗生素評價研究,2021,44(7):1541-1547.
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