【摘要】：缺血再灌注(／,I／R)損傷是導致移植后急性腎功能衰竭(AcuteRenal,ARF)和移植腎功能恢復延后(Graft,DGF)并最終造成移植腎短期和常年存活率增長的重要誘因之一。為此，深入揭示其作用機理將對腎移植后ARF和DGF預防有重要的理論和實際意義，是目前研究的重點和熱點。已發覺鉀離子通道激活是缺氧損傷的初期風波之一，也是造成腎缺血性損傷的重要誘因。喂奶植物細胞普遍存在K通道，其生理功能在不同的組織細胞中具有異質性，采用包括微電極技術，cDNA克隆和免疫組化等傳統方式對植物肝臟上皮細胞(cell,TEC)進行研究，發覺TEC鉀離子通道的主要作用包括：維持膜電流、K+的分泌、再循環和調節細胞容積。因為鉀離子通道私密性改變是細胞缺血再灌注損傷最直接的指標，也是I／R引起細胞損害的直接證據，而對于單個TEC鉀離子通道私密性改變與I／R關系的研究，目前國外外尚缺少報導。因此，本實驗擬采用研究單離子通道的膜片鉗技術，直接測定TEC缺血再灌注損傷后鉀離子通道變化，并采用特異性鉀離子通道阻斷劑Ba~(2+)驗證這種變化確實發生在鉀離子通道；同時觀察那些變化與細胞能量代謝及形態學改變之間的關系。
通過以上研究，為進一步深入了解腎缺血再灌注對TEC損傷的發生機制及其在腎移植后ARF以及DGF中的作用提供實驗根據。同時，初步闡述靶點鉀離子通道進行抗缺血再灌注損傷的預防策略，以及篩選特異性的鉀離子通道調節劑的可行性和有效性。主要方式：1．采用傳代培養人腎小管上皮細胞株，構建物理模擬缺血再灌注損傷模型。2．借助全細胞膜片鉗技術檢查正常培養TEC鉀離子通道特點及缺氧、氧化損傷后鉀離子通道改變。3．采用LDH測定試劑盒、ATP酶(Na~+、K~+和Ca~(2+)-ATP)試劑盒直接測定缺氧、氧化損傷后培養TEC能量代謝改變。4．采用免疫螢光方式測量缺氧、氧化損傷后TEC細胞骨架(微管、微絲、中間絲)改變。主要結果和推論如下：第三軍醫學院碩士學位論文1.缺氧、氧化損傷后TEC能量代謝改變:正常培養條件下，TEC培養基中乳酸酯化酶(LDH)的水平較低，缺氧、氧化損傷后LDH露出明顯降低(P0。01)，而缺氧組和氧化損傷組之間LDH露出比較無差別(P0.05)，說明缺氧、氧化損傷可以導致細胞膜完整性的破壞，破壞程度基本一致。在鈉鉀一腺普三乙酸酶活力、鈣一腺昔三乙酸酶活力抒發中，正常組明顯低于缺氧、氧化損傷組(P0.01)，而缺氧組、氧化損傷組之間比較無明顯性差別(P0.05)，進一步驗證物理致傷模型模擬缺血再灌注的可靠性和有效性。
2.缺氧、氧化損傷后細胞骨架改變:TEC骨架由微絲、微管、中間絲組成，缺氧、氧化損傷后細胞骨架破壞、塌陷，網路結構和支架作用消失，說明細胞骨架的動力特點使之對缺氧和氧化損傷非常敏感，是TEC形態結構破壞、代謝與功能禍合障礙的物質基礎和重要前提。3.正常培養TEC細胞鉀離子通道特點:平均靜息電位(RMP)為一42，56士7.35mV(n=15);串聯阻抗(Rs)為11.58土2.98M。細胞膜離子通道，膜電容(Rc)為10.51士x.g8PF，翻轉電位約為.40mV。對通道的開放與關掉活動的統計剖析表明，通道開放時間分布服從單指數函數，而關掉時間分布服從雙指數函數方式。通道開放的兩個時間常數分別為0.653ms與8.362ms，通道關掉的兩個時間常數分別為1，142ms與18，924ms。這與多數不同動物種屬TEC膜上鉀離子通道動力學模式是一致的。4.物理缺氧、氧化損傷后住C鉀離子通道改變:膜電位絕對值顯著降低，缺氧、氧化損傷和正常花C膜K+電壓均有電流依賴性，缺氧、氧化損傷組TEC的K+電壓振幅、膜電容和K+電壓密度現今小于正常飛C;與正常組TEC比較，缺氧、氧化損傷花C膜K+通道電壓抒發降低。缺氧、氧化損傷幾c的:值顯著高于正常TEC的:值，’這說明缺氧、氧化損傷TEC鉀離子通道的K+電壓較正常花C達到最大電壓振幅所須要時間更短，K+通道開放速率更快，活動提高，細胞內鈣超員細胞膜離子通道，導致細胞毒性物質的釋放，最終造成TEC的壞死和自噬。5.K+通道阻斷劑B擴十對三組TEC的作用:三組花C記錄到K+電壓后，加入5林mo比B擴+均能使跨膜K+電壓峰值顯著減少，說明本實驗記錄到的跨膜電壓為K+通道所形成的K十電壓。6.通過干擾鉀離子通道的變化，可能為預防缺血再灌注腎小管上皮細胞損傷提供新的方式。