【摘要】：缺血再灌注(／,I／R)損傷是導(dǎo)致移植后急性腎功能衰竭(AcuteRenal,ARF)和移植腎功能恢復(fù)延后(Graft,DGF)并最終造成移植腎短期和常年存活率增長(zhǎng)的重要誘因之一。為此，深入揭示其作用機(jī)理將對(duì)腎移植后ARF和DGF預(yù)防有重要的理論和實(shí)際意義，是目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。已發(fā)覺(jué)鉀離子通道激活是缺氧損傷的初期風(fēng)波之一，也是造成腎缺血性損傷的重要誘因。喂奶植物細(xì)胞普遍存在K通道，其生理功能在不同的組織細(xì)胞中具有異質(zhì)性，采用包括微電極技術(shù)，cDNA克隆和免疫組化等傳統(tǒng)方式對(duì)植物肝臟上皮細(xì)胞(cell,TEC)進(jìn)行研究，發(fā)覺(jué)TEC鉀離子通道的主要作用包括：維持膜電流、K+的分泌、再循環(huán)和調(diào)節(jié)細(xì)胞容積。因?yàn)殁涬x子通道私密性改變是細(xì)胞缺血再灌注損傷最直接的指標(biāo)，也是I／R引起細(xì)胞損害的直接證據(jù)，而對(duì)于單個(gè)TEC鉀離子通道私密性改變與I／R關(guān)系的研究，目前國(guó)外外尚缺少報(bào)導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用研究單離子通道的膜片鉗技術(shù)，直接測(cè)定TEC缺血再灌注損傷后鉀離子通道變化，并采用特異性鉀離子通道阻斷劑Ba~(2+)驗(yàn)證這種變化確實(shí)發(fā)生在鉀離子通道；同時(shí)觀察那些變化與細(xì)胞能量代謝及形態(tài)學(xué)改變之間的關(guān)系。
通過(guò)以上研究，為進(jìn)一步深入了解腎缺血再灌注對(duì)TEC損傷的發(fā)生機(jī)制及其在腎移植后ARF以及DGF中的作用提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。同時(shí)，初步闡述靶點(diǎn)鉀離子通道進(jìn)行抗缺血再灌注損傷的預(yù)防策略，以及篩選特異性的鉀離子通道調(diào)節(jié)劑的可行性和有效性。主要方式：1．采用傳代培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞株，構(gòu)建物理模擬缺血再灌注損傷模型。2．借助全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢查正常培養(yǎng)TEC鉀離子通道特點(diǎn)及缺氧、氧化損傷后鉀離子通道改變。3．采用LDH測(cè)定試劑盒、ATP酶(Na~+、K~+和Ca~(2+)-ATP)試劑盒直接測(cè)定缺氧、氧化損傷后培養(yǎng)TEC能量代謝改變。4．采用免疫螢光方式測(cè)量缺氧、氧化損傷后TEC細(xì)胞骨架(微管、微絲、中間絲)改變。主要結(jié)果和推論如下：第三軍醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文1.缺氧、氧化損傷后TEC能量代謝改變:正常培養(yǎng)條件下，TEC培養(yǎng)基中乳酸酯化酶(LDH)的水平較低，缺氧、氧化損傷后LDH露出明顯降低(P0。01)，而缺氧組和氧化損傷組之間LDH露出比較無(wú)差別(P0.05)，說(shuō)明缺氧、氧化損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性的破壞，破壞程度基本一致。在鈉鉀一腺普三乙酸酶活力、鈣一腺昔三乙酸酶活力抒發(fā)中，正常組明顯低于缺氧、氧化損傷組(P0.01)，而缺氧組、氧化損傷組之間比較無(wú)明顯性差別(P0.05)，進(jìn)一步驗(yàn)證物理致傷模型模擬缺血再灌注的可靠性和有效性。
2.缺氧、氧化損傷后細(xì)胞骨架改變:TEC骨架由微絲、微管、中間絲組成，缺氧、氧化損傷后細(xì)胞骨架破壞、塌陷，網(wǎng)路結(jié)構(gòu)和支架作用消失，說(shuō)明細(xì)胞骨架的動(dòng)力特點(diǎn)使之對(duì)缺氧和氧化損傷非常敏感，是TEC形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞、代謝與功能禍合障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要前提。3.正常培養(yǎng)TEC細(xì)胞鉀離子通道特點(diǎn):平均靜息電位(RMP)為一42，56士7.35mV(n=15);串聯(lián)阻抗(Rs)為11.58土2.98M。細(xì)胞膜離子通道，膜電容(Rc)為10.51士x.g8PF，翻轉(zhuǎn)電位約為.40mV。對(duì)通道的開(kāi)放與關(guān)掉活動(dòng)的統(tǒng)計(jì)剖析表明，通道開(kāi)放時(shí)間分布服從單指數(shù)函數(shù)，而關(guān)掉時(shí)間分布服從雙指數(shù)函數(shù)方式。通道開(kāi)放的兩個(gè)時(shí)間常數(shù)分別為0.653ms與8.362ms，通道關(guān)掉的兩個(gè)時(shí)間常數(shù)分別為1，142ms與18，924ms。這與多數(shù)不同動(dòng)物種屬TEC膜上鉀離子通道動(dòng)力學(xué)模式是一致的。4.物理缺氧、氧化損傷后住C鉀離子通道改變:膜電位絕對(duì)值顯著降低，缺氧、氧化損傷和正常花C膜K+電壓均有電流依賴(lài)性，缺氧、氧化損傷組TEC的K+電壓振幅、膜電容和K+電壓密度現(xiàn)今小于正常飛C;與正常組TEC比較，缺氧、氧化損傷花C膜K+通道電壓抒發(fā)降低。缺氧、氧化損傷幾c的:值顯著高于正常TEC的:值，’這說(shuō)明缺氧、氧化損傷TEC鉀離子通道的K+電壓較正常花C達(dá)到最大電壓振幅所須要時(shí)間更短，K+通道開(kāi)放速率更快，活動(dòng)提高，細(xì)胞內(nèi)鈣超員細(xì)胞膜離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放，最終造成TEC的壞死和自噬。5.K+通道阻斷劑B擴(kuò)十對(duì)三組TEC的作用:三組花C記錄到K+電壓后，加入5林mo比B擴(kuò)+均能使跨膜K+電壓峰值顯著減少，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)記錄到的跨膜電壓為K+通道所形成的K十電壓。6.通過(guò)干擾鉀離子通道的變化，可能為預(yù)防缺血再灌注腎小管上皮細(xì)胞損傷提供新的方式。