免疫螢光檢查細(xì)胞膜上的抗體用通透免疫螢光基本實(shí)驗(yàn)步驟基本實(shí)驗(yàn)步驟：（1）細(xì)胞打算。對(duì)雙層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成雙層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)漂浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心漂洗（，5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞活檢。（2）固定。按照須要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可放在含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS漂洗3×5min。（3）通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，通常須要在加入抗原孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗原才能抵達(dá)抗體部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗體蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間通常在5-15min。通透后用PBS漂洗3×5min。（4）封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間通常為30min。（5）一抗結(jié)合。溫度孵育1h或則4℃過夜。PBST洗滌3次，每次沖洗5min。（6）二抗結(jié)合。間接免疫螢光須要使用二抗。溫度避光孵育1h。PBST洗滌3次，每次沖洗5min后，再用分餾水洗滌一次。（7）封片及測(cè)量。滴加封丸劑一滴，封片，螢光顯微鏡檢測(cè)。
（一）細(xì)胞打算用于免疫螢光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞可以是直接生長(zhǎng)在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞，也可以是經(jīng)過離心后活檢的漂浮細(xì)胞或則是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后活檢。貼壁良好的細(xì)胞通常在培養(yǎng)時(shí)直接裝入讓細(xì)胞生長(zhǎng)在其上即可，盡量避開使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫螢光實(shí)驗(yàn)，以免后續(xù)的洗滌操作導(dǎo)致細(xì)胞開裂。少數(shù)實(shí)驗(yàn)須要使用這類細(xì)胞或則漂浮細(xì)胞進(jìn)行免疫螢光觀察，建議使用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞活檢。（二）固定和通透除研究細(xì)胞表面抗體或不穩(wěn)定抗體可不固定外，通常均應(yīng)固定。固定的目的有三：①防止細(xì)胞從玻片上開裂；②除去妨害抗體-抗原結(jié)合的類脂；③使標(biāo)本便于保存。標(biāo)本的固定原則是：①不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗體；②不能凝集蛋白質(zhì)；③應(yīng)保持細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；④固定后應(yīng)保持私密性，以保證抗原自由步入所有細(xì)胞與亞細(xì)胞組分與抗體結(jié)合。常用的固定劑有多種，應(yīng)按照所研究抗體的性質(zhì)和所使用的抗原特點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?。一般固定方式可以分為兩類：有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑。有機(jī)溶劑如乙醇和乙酸等可消除類脂并使細(xì)胞脫水，同時(shí)將細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛一般通過自由多肽羧基產(chǎn)生分子間橋連，因而形成一種抗體互相聯(lián)接的網(wǎng)路結(jié)構(gòu)。
交聯(lián)劑比有機(jī)溶劑更便于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，但由于交聯(lián)阻撓抗原結(jié)合，可能會(huì)增加一些細(xì)胞組分的抗體性，因而須要降低一個(gè)通透步驟以使抗原才能步入標(biāo)本。兩種固定方式都可能使蛋白抗體變性，因而使用變性蛋白作為抗體生產(chǎn)的抗原在免疫螢光中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和乙醇，少數(shù)情況也使用甲醇，乙醇及戊二醛等進(jìn)行固定。一般，細(xì)胞結(jié)構(gòu)抗體、病毒及一些酶類抗體使用乙醇、乙醇及高含量的甲醛固定可獲得較好的結(jié)果細(xì)胞膜抗原，而細(xì)胞膜相關(guān)組分抗體通常以多聚甲醛固定。細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒內(nèi)的抗體通常也用多聚甲醛固定，并須要進(jìn)行通透以使抗原能達(dá)到抗體表位。通透步驟只在檢查細(xì)胞內(nèi)抗體表位的時(shí)侯才須要細(xì)胞膜抗原，由于抗原須要步入細(xì)胞內(nèi)部去測(cè)量蛋白。并且，假如待測(cè)量的是跨膜蛋白，且其抗體表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣須要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透。相反，假如所測(cè)量的抗體表位坐落膜蛋白的胞外段，則不須要進(jìn)行通透。乙醇本身具有通透作用，因而用乙醇作為固定劑時(shí)是不須要通透的。乙醇同樣具有通透作用，但有些場(chǎng)合并不適宜用乙醇，由于一些表位對(duì)乙醇十分敏感。常用的通透劑是去垢劑，如，NP-40，以及Tween20,,和等。
和NP-40屬于烈性去垢劑，可部份溶化細(xì)胞核膜，因而特別適宜核抗體檢查。但應(yīng)當(dāng)注意的是，假如在高含量下使用或則作用時(shí)間過長(zhǎng)，它們將破壞蛋白，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。X-100是最常用的通透劑，并且它將破壞細(xì)胞膜，因而不適用于細(xì)胞膜相關(guān)抗體。前面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生足夠大的孔隙以容許抗原通過，并且不會(huì)溶化細(xì)胞質(zhì)膜。易于胞質(zhì)抗體或則質(zhì)膜上緊靠胞質(zhì)一面的抗體，也易于可溶的核抗體。通常的操作程序是先固定后通透，但針對(duì)有些水不胺類的目的抗體的測(cè)量宜先通透再固定，這樣做的緣由主要是可以通過通透消除許多水溶性的蛋白，進(jìn)而大大降低了免疫螢光的背景和非特異性訊號(hào)。固定后以冷PBS液洗滌，最后以分餾水沖洗，避免自發(fā)性螢光。（三）封閉封閉的目的是為了減輕抗原的非特異性結(jié)合，最常用的封閉劑為1%BSA,PBSpH7.5，其他可選擇的封閉劑還有1%,1%或與二抗種生肖同的血漿（3-10%）等。（四）抗原孵育直接免疫螢光法中的一抗和間接免疫螢光法中的二抗都是螢光抗原，因而在這種抗原孵育的時(shí)侯必須注意避光。據(jù)悉，為保證結(jié)合質(zhì)量和避免干燥，抗原孵育應(yīng)盡量在濕盒中進(jìn)行。
（五）封片及螢光觀察標(biāo)記好螢光的細(xì)胞片原則上可以直接進(jìn)行觀察，非常是有時(shí)侯封片不當(dāng)反倒促使前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結(jié)果，便于進(jìn)一步觀察、照像、統(tǒng)計(jì)剖析等，需作封片處理。常規(guī)的方式是采用甘油或中性樹脂封片，為了提高封片的療效，常常須要在封片時(shí)添加特殊的抗螢光淬滅劑。（六）標(biāo)本保存因?yàn)槲灩馍睾偷鞍踪|(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對(duì)的，因而隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，在各類條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，喪失其應(yīng)有的照度和特異性。為此給標(biāo)本的保存帶來(lái)一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行螢光染色過后應(yīng)立刻觀察。因?yàn)樾阅芰己玫目刮灩獯銣鐒┑某霈F(xiàn)，螢光標(biāo)記的標(biāo)本可以在高溫（4℃或-20℃）下保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。在個(gè)別情形下，考慮到實(shí)驗(yàn)的成本及實(shí)驗(yàn)條件，也可以采取權(quán)宜的辦法，例如固定標(biāo)本片后高溫保存，在須要時(shí)再進(jìn)行螢光標(biāo)記，即隨用隨染。