【摘要】：目的：胃癌卡介苗(tumor)是指給機體直接或間接輸入的具有抗體性的成份，它可剌激機體免疫系統形成抗肺癌免疫效應，用于醫治肝病。病變細胞的抗體(，Ag)絕大部份為細胞膜蛋白。搜集其進行研究，對于找尋高效病變抗體具有重要意義。本研究采用改良的法和強堿洗脫法搜集不同分子量的人食道癌細胞株Eca-109細胞膜蛋白，找尋能導致免疫反應的癌癥抗體，篩選出高效癌癥抗體的大致范圍，為食道癌的免疫醫治提供根據。方式：1．提取Eca-109細胞膜蛋白：使用改良的法先提取細胞膜。之后在pH6.3的條件下，用去垢劑()Ⅹ-100和辛基β-葡糖甙(octylβ-)，把細胞膜上的蛋白溶化出來，以超濾法純化膜蛋白并分組。2．以超濾法純化膜蛋白并分組：以超濾法將膜蛋白從以Ⅹ-100作去垢劑的成份中按分子量大小分出＜3KD、3～10KD、＜10KD、10～30KD四個組；從以辛基β-葡糖甙做去垢劑的成份中分離出30～100KD、＞100KD兩個組，并測定各組膜蛋白含量。3．測定膜蛋白的含量：用測量法，在pH6.3、波長595nm處，制做蛋白標準曲線，測定富含去垢劑的各組膜蛋白含量，推導入適當的去垢劑與膜蛋白之比(即mg去垢劑／mg膜蛋白)。
4．檢查Eca-109細胞的HLA表型及篩選健康志愿者：使用HLA質粒試劑盒，瓊脂糖凝膠電泳(gel)觀察聚合酶鏈反應(，PCR)擴增后的DNA產物，鑒別出Eca-109細胞的HLA表型。采用血漿學HLA分型技術細胞膜抗原，找尋起碼有一個HLAⅠ類基因位點與Eca-109細胞HLA相匹配的健康志愿者。5．人外周血DC的培養：取篩選出的志愿者的外周血，密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞(bloodcells，PBMC)，用含粒細胞-巨噬新鄉學院2004年博士學位論文人膽管癌Eca一109細胞膜病變杭原篩選的研究細胞集落剌激因子(一macro坤昭eeolo妙飛，GM一CSF)、白細胞介素一4(一4，IL一4)及該志愿者血漿的即Ml1640培養液調整細胞密度后，加入24孔板中培養。于培養的第4天，按照一定比列加入膜蛋白，第6天加入LPS促使DC成熟，于第7天收獲成熟的漂浮DC。
冷藏保存抗體負載的成熟DC:富含10%DMSO和5%藍莓糖的純自身血漿作為凍存液，可以將密度為10xl護/ml抗體負載的成熟DC，以每分鐘降溫1℃，放置于液氮的液相中保存。6.人外周血T細胞的培養:在IL一2維持下，流式細胞儀測量此志愿者PBMC的分化情況。依據測量結果，再收獲PBMC，經過換培養瓶及PHA剌激，以含hIL一2的RPMI1640培養液常規培養PBMC4周，搜集純化的T細胞。7.MTT法測定致畸T細胞的細胞毒活性:以純化的T細胞為效應細胞，加入抗體負載的成熟DC，以8:l、16:l、32:l的效靶比分別加入Eea.109細胞(其為靶細胞);同時設陰性對照組、陰性對照組及效應對照組，各組設3個復孔，用MTT法在%孔板中測定CTL的細胞毒活性。8.強酸洗脫法:雙層生長的Eca一109細胞每晚按如下方式處理:除去培養液，PBS洗三次，每斤加5ml構椽酸一乙酸鹽緩沖液(pH3.3)溫度作用lmin，使MHC分子變性，釋放MHC分子結合的膚入堿液。病變細胞經PBS洗3次，用培養液繼續培養。每斤細胞最多酸洗3次棄去。富含膚的酸洗液經過seP一PakC18柱脫鹽、真空濃縮和YM·3()超過濾，一ZooC凍存。
9.反相高效氣相(RP一HPLC)剖析:Eca一109細胞細胞膜酸洗膚用HPLC分離，流速lml/min，用O%~70%梯度(v八護)0.085%TEA的乙睛氨水(B液)洗脫，水相為含0.085%TFA的水氨水。自動搜集各峰，脫鹽、濃縮和干燥，一20℃凍存。10.病變特異性細胞毒性〔CTL)T淋巴細胞的體外誘導:取該志愿者負載不同組分抗體膚的DC作為剌激細胞，在剌激細胞培養孔中加入自身外周血淋巴細胞，于24h后，再加入等容積的含ZOU/mlth一IL一2繼續培養，每3天換液1次。每7天應用剌激細胞重復剌激淋巴細胞1次，共培養21天。11.”c:釋放試驗檢查cTL殺傷活性:Eca一109細胞為靶細胞，在4xl護細胞中加入100pCiNa25’CrO;，在溫度中放置lh，不時搖晃。用大量HankS液充分漂洗細胞3次，去除游離鉻，配成5x10勺m1病變細胞懸液。細胞以50:1效靶細胞比加入96孔U一底培養板(200pl/孔)培養4h。每位樣品設置3個復孔，搜集培養上清，用Y計數儀測量上清CPM值。富含淋巴細胞、不負載抗體DC和靶細胞的孔為對照孔。結果:廣州學院2004年博士學位論文人食道癌Eca一109細胞膜病變抗體篩選的研究1.在pH6.3的條件下，適當的去垢劑與膜蛋白之比(即mg去垢劑/mg膜蛋白)，在使用辛基p一葡糖昔時為6:1;使用腸妞。
nX一100時為2:1。2.Eea-log細胞的HLA的基因分型為A，03，A細胞膜抗原，24;B，35，B，37;n盼l’01，DRBI’12;DRB3。并找到一例表型為A03雜合子的健康志愿者。3.PBMC的分化情況:健康人PBMC，只在IL一2維持下，用流式細胞儀測量其分化情況。B細胞于第1周時基本死亡，第3周時完全消失;NK細胞于第1周時顯著降低，于第4周時