【技術領域】
[0001]本發明屬于生物領域，具體涉及一種快速降低細胞膜私密性的細胞內液及其技巧。
【背景技術】
[0002]全細胞膜片鉗技術是用玻璃微電極貼附在細胞表面，施加負壓使電極與細胞之間產生高阻封接(即GD級的緊密封接)。在實驗中，向玻璃電極內液中加入特定的藥物，如兩性霉素B，可以使細胞膜穿孔，細胞內液和電極內液連通，這樣記錄到的玻璃電極內和細胞所處香波之間的電勢差即為細胞的膜電位。藥物穿孔產生的孔道，分子半徑小于0.Snm的離子和分子不能通過，而所有總價離子都可通過，這種孔道沒有電流依賴性，同時促使記錄過程不受電極鉗制電位的影響。
[0003]兩性霉素B是一種具有抗菌或滅菌作用的抗霉菌劑。主要是通過作用于細胞膜上的麥角留醇而改變細胞膜私密性。其實全細胞膜片鉗技術須要兩性霉素B打孔，然而兩性霉素B基本不溶于水堿液，易產生固體漂浮顆粒，極易堵塞玻璃微電極尖端；兩性霉素B打孔療效不好，從電極貼附產生高阻封接到細胞破膜常常要30min以上。因而對穿孔膜片鉗實驗帶了一定難度。
【發明內容】
[0004]本發明的第一個目的是提供一種快速降低細胞膜私密性的細胞內液。
[0005]本發明的快速降低細胞膜私密性的細胞內液，其特點在于，先將兩性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，之后將兩性霉素B的DMSO氨水、質量分數0.3%的X-100氨水和常規細胞內液根據容積比50:10:1000的比列混和均勻，由此得到快速降低細胞膜私密性的細胞內液。
[0006]所述的快速降低細胞膜私密性的細胞內液優選通過以下方式制備:
[0007]將每0.0lg的兩性霉素B溶化于ImLDMSO,放在渦旋振蕩器上以怠速回落2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻度超聲lOmin，最終配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，再按每汲取50μL兩性霉素B的DMSO氨水、1yL質量分數0.3%的的X-100堿液溶于ImL的常規細胞內液中，放在渦旋振蕩器上回落lmin，之后以40KHz的頻度超聲lOmin，最后在以的怠速離心30s發覺無漂浮顆粒沉降，由于漂浮顆粒的存在可能堵塞玻璃電極微米級的開口引起電壓回路不暢，記錄數據不穩定，由此得到快速降低細胞膜私密性的細胞內液。
[0008]所述的常規細胞內液為富含130mM,24mMCsCl,1mMHEPES,,ImMMgCl2，溶劑為水。其配制方式是將上述成份混和均勻殺菌備用。
[0009]本發明的第二個目的是提供一種快速降低細胞膜私密性因而快速破膜產生高阻封接的方式，其特點在于，將含伊維菌素的細胞外液灌入快速投藥管中，再將上述快速降低細胞膜私密性的細胞內液灌入微電極中，之后借助含快速降低細胞膜私密性的細胞內液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速投藥管口，打開快速投藥管，使細胞在含伊維菌素的細胞外液中孵育，使細胞在電生理測試狀態下Ra值降至10ΜΩ，再停止孵育。
[0010]將伊維菌素溶于常規細胞外液(富含154mMNaCl，1mMD-，1mMHEPES,ImMCaCl2，溶劑為水，其配制方式是將上述成份按其濃度混和均勻即可)中，使伊維菌素的含量為2μΜ，由此得到含伊維菌素的細胞外液。
[0011]兩性霉素B對細胞膜私密性的影響具有含量依賴性，怎么最大限度的讓兩性霉素B溶化于細胞內液的同時結合伊維菌素快速降低細胞膜的私密性，達到最短時間且最佳的穿透療效借此解決穿孔膜片鉗應用的主要問題。本發明解決兩性霉素B在細胞內液中的溶化度，借助X-100作為非離子型表面活性劑能促使兩性霉素B溶化，使其較好的溶化于細胞內液中，在整個實驗過程中兩性霉素B處于水溶化狀態，同時結合伊維菌素降低細胞膜通透特點，實驗開始前孵育細胞輔助兩性霉素B—起在短時間內破膜，在此含量下的X-100堿液可以破壞細胞膜上的脂類在細胞膜表面打孔，促使細胞膜穿孔產生，且對細胞無毒副作用，不影響細胞的狀態。破膜后停止撫育，同時在兩性霉素B的幫助下穩定細胞膜處于穩定通透狀態，進而使細胞還能在l_2h內處于穩定的電壓記錄狀態。
[0012]為此本發明的快速降低細胞膜私密性的細胞內液，并結合伊維菌素快速降低細胞膜私密性因而在膜片鉗實驗中快速破膜產生高阻封接進行實驗。
【具體施行方法】
[0013]以下施行例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0014]施行例1:
[0015]將0.0lg的兩性霉素B溶化于ImLDMS0，放在渦旋振蕩器上以高速回落2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻度超聲lOmin細胞膜片，最終配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO氨水。汲取50μL兩性霉素B的DMSO氨水、10μL質量分數0.3%的X-100氨水(將0.3g的X-100溶于10ml的水底，得到質量分數0.3%的X-100堿液)溶于ImL細胞內液(富含130mM,24mMCsCl,1mMHEPES,ImMCaCl2,ImMMgCl2,溶劑為水)中，放在渦旋振蕩器上高速回落lmin，之后以40KHz的頻度超聲lOmin，最后再以的怠速離心30s發覺無漂浮顆粒沉降，由此得到快速降低細胞膜私密性的細胞內液。
[0016]之后將伊維菌素溶于常規細胞外液(富含154mMNaCl,1mMD-,,ImMCaCl2，溶劑為水)中，使伊維菌素的含量為2μM，由此得到含伊維菌素的細胞外液。
[0017]將1ml本施行例的含伊維菌素的細胞外液灌入快速投藥管中，再將本施行例的快速降低細胞膜私密性的細胞內液灌入微電極中，之后借助含快速降低細胞膜私密性的細胞內液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速投藥管口(含伊維菌素的細胞外液的投藥管口)，打開快速投藥管。細胞在含伊維菌素的細胞外液中孵育2min后細胞在電生理測試狀態下Ra值降至10MΩ，停止孵育。依此方式得到的細胞可以在2min內快速溶化細胞膜，同時電極內部的兩性霉素B繼續與細胞膜中的麥角留醇互相作用維持細胞膜常年處于穩定的通透狀態，可以在l_2h內記錄到穩定的電壓結果，不會由于細胞膜在記錄過程中反復的閉合導致記錄中斷，而且在此過程中對細胞的狀態無影響，無毒副作用。
【主權項】
1.一種快速降低細胞膜私密性的細胞內液，其特點在于，其是先將兩性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，之后將兩性霉素B的DMSO氨水、質量分數0.3%的X-100氨水和常規細胞內液根據容積比50:10:1000的比列混和均勻，由此得到快速降低細胞膜私密性的細胞內液。2.按照權力要求1所述的細胞內液，其特點在于細胞膜片，所述的快速降低細胞膜私密性的細胞內液是通過以下方式制備:將每0.0lg的兩性霉素B溶化于ImLDMSO,放在渦旋振蕩器上以怠速回落2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻度超聲lOmin，最終配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，再按每汲取50μL兩性霉素B的DMSO氨水、10μL質量分數0.3%的的-100堿液溶于ImL的常規細胞內液中，放在渦旋振蕩器上回落lmin，之后以40KHz的頻度超聲lOmin，最后在以的怠速離心30s發覺無漂浮顆粒沉降，由此得到快速降低細胞膜私密性的細胞內液。3.按照權力要求1所述的細胞內液，其特點在于，所述的常規細胞內液為富含,24mMCsCl,1mMHEPES,ImMCaCl2,ImMMgCl2，溶劑為水。4.一種快速降低細胞膜私密性因而快速破膜產生高阻封接的方式，其特點在于，將含伊維菌素的細胞外液灌入快速投藥管中，再將權力要求1所述的快速降低細胞膜私密性的細胞內液灌入微電極中，之后借助含快速降低細胞膜私密性的細胞內液的微電極鉗制細胞達到高阻封接后，提起貼壁細胞至快速投藥管口，打開快速投藥管，使細胞在含伊維菌素的細胞外液中孵育，使細胞在電生理測試狀態下Ra值降至10ΜΩ左右，再停止孵育。5.按照權力要求4所述的方式，其特點在于，所述的含伊維菌素的細胞外液，其制備方式是將伊維菌素溶于常規細胞外液中，使伊維菌素的含量為2μΜ，由此得到含伊維菌素的細胞外液。6.按照權力要求5所述的方式，其特點在于，所述的常規細胞外液富含,1mMD-，1mMHEPES,ImMCaCl2，溶劑為水。
【專利摘要】本發明公開了一種快速降低細胞膜私密性的細胞內液及其方式。先將兩性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，之后將兩性霉素B的DMSO堿液、質量分數0.3％的X-100堿液和常規細胞內液根據容積比50：10：1000的比列混和均勻，由此得到快速降低細胞膜私密性的細胞內液。本發明的快速降低細胞膜私密性的細胞內液，并結合伊維菌素快速降低細胞膜私密性因而在膜片鉗實驗中快速破膜產生高阻封接進行實驗。
【IPC分類】C12Q1/02
【公開號】
【申請號】CN2
【發明人】李志遠,精湛,劉靜馨
【申請人】中國科大學上海生物醫藥與健康研究院
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月27日