一種快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液及其方式
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液及其技巧。
【背景技術(shù)】
[0002]全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極貼附在細(xì)胞表面，施加負(fù)壓使電極與細(xì)胞之間產(chǎn)生高阻封接(即GD級(jí)的緊密封接)。在實(shí)驗(yàn)中，向玻璃電極內(nèi)液中加入特定的藥物，如兩性霉素B，可以使細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞內(nèi)液和電極內(nèi)液連通，這樣記錄到的玻璃電極內(nèi)和細(xì)胞所處香波之間的電勢(shì)差即為細(xì)胞的膜電位。藥物穿孔產(chǎn)生的孔道，分子半徑小于0.Snm的離子和分子不能通過(guò)，而所有總價(jià)離子都可通過(guò)，這種孔道沒(méi)有電流依賴(lài)性，同時(shí)促使記錄過(guò)程不受電極鉗制電位的影響。
[0003]兩性霉素B是一種具有抗菌或滅菌作用的抗霉菌劑。主要是通過(guò)作用于細(xì)胞膜上的麥角留醇而改變細(xì)胞膜私密性。其實(shí)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)須要兩性霉素B打孔，然而兩性霉素B基本不溶于水堿液，易產(chǎn)生固體漂浮顆粒，極易堵塞玻璃微電極尖端；兩性霉素B打孔療效不好，從電極貼附產(chǎn)生高阻封接到細(xì)胞破膜常常要30min以上。因而對(duì)穿孔膜片鉗實(shí)驗(yàn)帶了一定難度。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。
[0005]本發(fā)明的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液，其特點(diǎn)在于，先將兩性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，之后將兩性霉素B的DMSO氨水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的X-100氨水和常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液根據(jù)容積比50:10:1000的比列混和均勻，由此得到快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。
[0006]所述的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液優(yōu)選通過(guò)以下方式制備:
[0007]將每0.0lg的兩性霉素B溶化于ImLDMSO,放在渦旋振蕩器上以怠速回落2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻度超聲lOmin，最終配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，再按每汲取50μL兩性霉素B的DMSO氨水、1yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的的X-100堿液溶于ImL的常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液中，放在渦旋振蕩器上回落lmin，之后以40KHz的頻度超聲lOmin，最后在以的怠速離心30s發(fā)覺(jué)無(wú)漂浮顆粒沉降，由于漂浮顆粒的存在可能堵塞玻璃電極微米級(jí)的開(kāi)口引起電壓回路不暢，記錄數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，由此得到快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。
[0008]所述的常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液為富含130mM,24mMCsCl,1mMHEPES,,ImMMgCl2，溶劑為水。其配制方式是將上述成份混和均勻殺菌備用。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種快速降低細(xì)胞膜私密性因而快速破膜產(chǎn)生高阻封接的方式，其特點(diǎn)在于，將含伊維菌素的細(xì)胞外液灌入快速投藥管中，再將上述快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液灌入微電極中，之后借助含快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液的微電極鉗制細(xì)胞達(dá)到高阻封接后，提起貼壁細(xì)胞至快速投藥管口，打開(kāi)快速投藥管，使細(xì)胞在含伊維菌素的細(xì)胞外液中孵育，使細(xì)胞在電生理測(cè)試狀態(tài)下Ra值降至10ΜΩ，再停止孵育。
[0010]將伊維菌素溶于常規(guī)細(xì)胞外液(富含154mMNaCl，1mMD-，1mMHEPES,ImMCaCl2，溶劑為水，其配制方式是將上述成份按其濃度混和均勻即可)中，使伊維菌素的含量為2μΜ，由此得到含伊維菌素的細(xì)胞外液。
[0011]兩性霉素B對(duì)細(xì)胞膜私密性的影響具有含量依賴(lài)性，怎么最大限度的讓兩性霉素B溶化于細(xì)胞內(nèi)液的同時(shí)結(jié)合伊維菌素快速降低細(xì)胞膜的私密性，達(dá)到最短時(shí)間且最佳的穿透療效借此解決穿孔膜片鉗應(yīng)用的主要問(wèn)題。本發(fā)明解決兩性霉素B在細(xì)胞內(nèi)液中的溶化度，借助X-100作為非離子型表面活性劑能促使兩性霉素B溶化，使其較好的溶化于細(xì)胞內(nèi)液中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩性霉素B處于水溶化狀態(tài)，同時(shí)結(jié)合伊維菌素降低細(xì)胞膜通透特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前孵育細(xì)胞輔助兩性霉素B—起在短時(shí)間內(nèi)破膜，在此含量下的X-100堿液可以破壞細(xì)胞膜上的脂類(lèi)在細(xì)胞膜表面打孔，促使細(xì)胞膜穿孔產(chǎn)生，且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，不影響細(xì)胞的狀態(tài)。破膜后停止撫育，同時(shí)在兩性霉素B的幫助下穩(wěn)定細(xì)胞膜處于穩(wěn)定通透狀態(tài)，進(jìn)而使細(xì)胞還能在l_2h內(nèi)處于穩(wěn)定的電壓記錄狀態(tài)。
[0012]為此本發(fā)明的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液，并結(jié)合伊維菌素快速降低細(xì)胞膜私密性因而在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中快速破膜產(chǎn)生高阻封接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
【具體施行方法】
[0013]以下施行例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0014]施行例1:
[0015]將0.0lg的兩性霉素B溶化于ImLDMS0，放在渦旋振蕩器上以高速回落2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻度超聲lOmin細(xì)胞膜片，最終配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO氨水。汲取50μL兩性霉素B的DMSO氨水、10μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的X-100氨水(將0.3g的X-100溶于10ml的水底，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的X-100堿液)溶于ImL細(xì)胞內(nèi)液(富含130mM,24mMCsCl,1mMHEPES,ImMCaCl2,ImMMgCl2,溶劑為水)中，放在渦旋振蕩器上高速回落lmin，之后以40KHz的頻度超聲lOmin，最后再以的怠速離心30s發(fā)覺(jué)無(wú)漂浮顆粒沉降，由此得到快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。
[0016]之后將伊維菌素溶于常規(guī)細(xì)胞外液(富含154mMNaCl,1mMD-,,ImMCaCl2，溶劑為水)中，使伊維菌素的含量為2μM，由此得到含伊維菌素的細(xì)胞外液。
[0017]將1ml本施行例的含伊維菌素的細(xì)胞外液灌入快速投藥管中，再將本施行例的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液灌入微電極中，之后借助含快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液的微電極鉗制細(xì)胞達(dá)到高阻封接后，提起貼壁細(xì)胞至快速投藥管口(含伊維菌素的細(xì)胞外液的投藥管口)，打開(kāi)快速投藥管。細(xì)胞在含伊維菌素的細(xì)胞外液中孵育2min后細(xì)胞在電生理測(cè)試狀態(tài)下Ra值降至10MΩ，停止孵育。依此方式得到的細(xì)胞可以在2min內(nèi)快速溶化細(xì)胞膜，同時(shí)電極內(nèi)部的兩性霉素B繼續(xù)與細(xì)胞膜中的麥角留醇互相作用維持細(xì)胞膜常年處于穩(wěn)定的通透狀態(tài)，可以在l_2h內(nèi)記錄到穩(wěn)定的電壓結(jié)果，不會(huì)由于細(xì)胞膜在記錄過(guò)程中反復(fù)的閉合導(dǎo)致記錄中斷，而且在此過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)無(wú)影響，無(wú)毒副作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液，其特點(diǎn)在于，其是先將兩性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，之后將兩性霉素B的DMSO氨水、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的X-100氨水和常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液根據(jù)容積比50:10:1000的比列混和均勻，由此得到快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。2.按照權(quán)力要求1所述的細(xì)胞內(nèi)液，其特點(diǎn)在于細(xì)胞膜片，所述的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液是通過(guò)以下方式制備:將每0.0lg的兩性霉素B溶化于ImLDMSO,放在渦旋振蕩器上以怠速回落2min，混勻后放置在超聲儀中以40KHz的頻度超聲lOmin，最終配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，再按每汲取50μL兩性霉素B的DMSO氨水、10μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的的-100堿液溶于ImL的常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液中，放在渦旋振蕩器上回落lmin，之后以40KHz的頻度超聲lOmin，最后在以的怠速離心30s發(fā)覺(jué)無(wú)漂浮顆粒沉降，由此得到快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。3.按照權(quán)力要求1所述的細(xì)胞內(nèi)液，其特點(diǎn)在于，所述的常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液為富含,24mMCsCl,1mMHEPES,ImMCaCl2,ImMMgCl2，溶劑為水。4.一種快速降低細(xì)胞膜私密性因而快速破膜產(chǎn)生高阻封接的方式，其特點(diǎn)在于，將含伊維菌素的細(xì)胞外液灌入快速投藥管中，再將權(quán)力要求1所述的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液灌入微電極中，之后借助含快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液的微電極鉗制細(xì)胞達(dá)到高阻封接后，提起貼壁細(xì)胞至快速投藥管口，打開(kāi)快速投藥管，使細(xì)胞在含伊維菌素的細(xì)胞外液中孵育，使細(xì)胞在電生理測(cè)試狀態(tài)下Ra值降至10ΜΩ左右，再停止孵育。5.按照權(quán)力要求4所述的方式，其特點(diǎn)在于，所述的含伊維菌素的細(xì)胞外液，其制備方式是將伊維菌素溶于常規(guī)細(xì)胞外液中，使伊維菌素的含量為2μΜ，由此得到含伊維菌素的細(xì)胞外液。6.按照權(quán)力要求5所述的方式，其特點(diǎn)在于，所述的常規(guī)細(xì)胞外液富含,1mMD-，1mMHEPES,ImMCaCl2，溶劑為水。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液及其方式。先將兩性霉素B溶化于DMSO中，配制成10mg/mL兩性霉素B的DMSO堿液，之后將兩性霉素B的DMSO堿液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3％的X-100堿液和常規(guī)細(xì)胞內(nèi)液根據(jù)容積比50：10：1000的比列混和均勻，由此得到快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液。本發(fā)明的快速降低細(xì)胞膜私密性的細(xì)胞內(nèi)液，并結(jié)合伊維菌素快速降低細(xì)胞膜私密性因而在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中快速破膜產(chǎn)生高阻封接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/02
【公開(kāi)號(hào)】
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N2
【發(fā)明人】李志遠(yuǎn),精湛,劉靜馨
【申請(qǐng)人】中國(guó)科大學(xué)上海生物醫(yī)藥與健康研究院
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日