傳統(tǒng)固態(tài)黃酒釀制體系是天然的微生物育種平臺，其奇特的多壓力脅迫（高酸、高滲、高丙酮、高溫等）微環(huán)境為弧菌自然定性進化提供了良好的條件。那些具有高耐受性的功能菌種在釀制過程中發(fā)揮著重要作用，與發(fā)酵品質息息相關，決定了基酒產值和質量。更為重要的是，為科學理解細胞耐受調控分子機制提供了獨一無二的研究素材。
微生物經過長時間自然馴養(yǎng)早已進化出了一套可以快速響應胞外環(huán)境變化的調控機制，以確保細胞可以在最短時間內按照外界壓力因子的變化來調節(jié)細胞自身的代謝和狀態(tài)，進而確保細胞的繁衍和生存。眾所周知，細胞膜是細胞體會、響應胞外酸脅迫因子的前沿哨卡，膜上的功能區(qū)域空間結構具有實時動態(tài)變化的特征，但是這種空間結構與傳感器器件功能的發(fā)揮息息相關。但是，關于細胞耐堿性能的研究多集中在胞內的響應調節(jié)，而細胞膜有什么結構或是器件參與其中，是怎樣將壓力訊號傳遞進細胞，從而導致細胞內的應激反應卻鮮有報導。上海科技學院現(xiàn)代釀制技術團隊張翠英院士課題組首次報導了濃香型黃酒釀制功能微生物粟酒裂殖酵母在酸脅迫下細胞膜亞結構動態(tài)變化以及其與細胞耐堿性能的關聯(lián)機制。該文章于2022年10月8日以“Thetoacidofyeastbycell”為題在Food（IF=6.374）上發(fā)表。
有機酸擾動造成結構動態(tài)變化
比較轉錄組數(shù)據表明在高耐堿弧菌Sp.65與實驗室弧菌S.pombe中，結構器件pil1、pil2、fhn1、sle1、eis1和meu14的抒發(fā)水平存在明顯變化（圖1），這暗示著細胞的耐堿性與之間可能存在一定的關系。
圖1.結構基因在高耐堿弧菌和實驗室弧菌中抒發(fā)變化的驗證
支架BAR結構域蛋白是的基本組成器件。在S.pombe中，BAR結構域蛋白由pil1編碼。為了進一步探究是否與弧菌的有機酸耐受性存在聯(lián)系，以Sp.65為出發(fā)弧菌，采用紅色螢光蛋白EGFP標記Pil1，并用CLSM對Pil1-EGFP進行成像觀察。與對照相比，加入乙醇造成了不規(guī)則的結構，且螢光訊號迅速明顯減少，這反映了對酸脅迫的快速響應。
圖2酸脅迫下的動態(tài)變化。不同酸處理下攜帶Pil1-EGFP的Sp.65的螢光顯微鏡(a)和螢光硬度FI(b)。(c)苯酚和乳酸脅迫下的組裝相關基因抒發(fā)變化。CK（對照）為不加酸，AA為8g/L乙醇，LA為30g/L乳酸。
基因pil1、fhn1和sle1對維持的完整性至關重要
共聚焦結果顯示完整的分布于細胞膜的表面，呈現(xiàn)出致密、連續(xù)不間斷的腰線狀（圖4a）。在基因缺位突變pil2Δ，eis1Δ和meu14Δ中，沒有觀察到結構與出發(fā)弧菌存在差別。而基因pil1，fhn1以及sle1的缺位則造成連續(xù)性中斷以及產率增加。
同時，筆者借助TEM進行觀測，發(fā)覺pil1的缺位明顯降低了梨狀渦結構的數(shù)目(圖4b)，其中，WT中數(shù)目為2.07個/μm2，而pil1Δ中數(shù)目僅為0.21個/μm2細胞膜結構模式圖，二者相差約10倍(圖4c)。
圖4.單個基因pil1、fhn1或sle1的缺位引起了的破壞。(a)WTPil1-EGFP、pil2Δ、eis1ΔPil1-EGFP、meu14ΔPil1-EGFP、pil1ΔFhn1-EGFP、fhn1ΔPil1-EGFP和sle1ΔPil1-EGFP的顯微觀察。(b)透射電鏡觀察到的質膜形態(tài)。(c)WT和pil1Δ中的數(shù)目。
的破壞增加了酵母的耐堿性
比較了不同酸脅迫條件下pil1Δ、fhn1Δ、sle1Δ、pil2Δ、meu14Δ、eis1Δ和WT的生長表型。半定量黑斑試驗的結果表明，在無酸條件下，這種基因的缺位不影響酵母的生長(圖5a)。在16g/L乙醇(pH=3.84)脅迫下，弧菌pil1Δ、fhn1Δ和sle1Δ的生長性能較WT明顯下滑，而在磷酸脅迫下，pil2、eis1和meu14的缺位并沒有導致生長表型的變化。在乳酸脅迫下觀察到與磷酸脅迫下相像的生長表型變化。液體發(fā)酵生長曲線也與平板實驗相一致(圖5b)。因而可以推測結構完整性對于維持粟酒裂殖酵母的抗磷酸、抗乳酸能力是不可或缺的。
圖5保持結構完整性有助于維持粟酒裂殖酵母有機酸耐受性。a：半定量點種法評價自交弧菌與基因缺位突變弧菌在不同處理條件下的生長性能；b：生長曲線法評價自交弧菌與基因缺位突變弧菌在不同處理條件下的生長性能；CK代表無脅迫處理，AA代表16g/L磷酸，LA代表60g/L乳酸。
的破壞減緩了細胞內酸的積累和ROS的下降。
是細胞膜的一個子結構域細胞膜結構模式圖，猜想其形態(tài)的改變可能會影響細胞膜的性質。因而，采用碘化丙啶染色法剖析WT和基因缺位突變體在不同處理條件下的細胞膜完整性。在無酸條件下，碘化丙啶染色細胞的比列為WT的10.5±2.2%，而在8g/L磷酸和40g/L乳酸(pH=2.89)脅迫下，分別為22.8±3.8和26.3±4.7%(圖6a)。這種結果表明，酸脅迫對細胞膜的完整性有不同程度的破壞。值得注意的是，pil2Δ、eis1Δ和meu14Δ中碘化丙啶染色細胞的比列與WT中無明顯差別，但pil1、fhn1或sle1的缺位造成比列明顯降低。在酸脅迫下，該比列的降低更為顯著。
之后檢查了細胞內酸濃度和ROS水平。分別用8g/L磷酸和40g/L乳酸處理4h后，WT細胞內磷酸濃度為1795.17±124.24μg/g，乳酸濃度為16.56±1.56mg/g(圖6c和d)。在相同處理條件下，pil1Δ弧菌的乙醇濃度為2579.33±133.13μg/g，乳酸濃度為22.51±0.75mg/g。與WT相比，細胞內酸濃度分別提升了35.93%和43.68%。在fhn1Δ和sle1Δ弧菌中也觀察到類似的趨勢。在無酸條件下，各菌種的ROS水平相仿。在酸脅迫下，pil1Δ、fhn1Δ和sle1Δ的ROS水平明顯下降，這與細胞內酸積累的降低一致。
圖6.不同基因缺位對細胞膜完整性、細胞內酸酐濃度和ROS水平的影響。(a)碘化丙啶染色細胞的比率。(b)細胞內ROS水平。細胞內積累的乙醇(c)和乳酸(d)。CK(對照檢測)表示未加酸，AA表示8g/L乙醇，LA表示40g/L乳酸。圖a和圖b的明顯性剖析結果為相同處理條件下，不同菌種碘化丙啶染色細胞與ROS水平的比較。圖c、d明顯性剖析結果為各菌種在8g/L乙醇和40g/L乳酸脅迫下胞內酸積累的比較。
破壞對關鍵膜蛋白和細胞壁完整性的影響
膜蛋白包括Fps1、Ady2、Jen1、Pma1和Pdr18是決定釀酒酵母胞內酸酐積累的關鍵元素。通過RT-qPCR剖析WT和pil1Δ菌種中相關膜蛋白編碼基因的相對抒發(fā)量。相關膜蛋白編碼基因包括mug86(ADY2的同源基因)、pma1(pma1的同源基因)、pdr1和bfr1(均為PDR18的同源基因)。
如圖7a所示，在酸脅迫下，介導乙酸鹽步入細胞的基因mug86遭到了嚴重的抑制。在乙醇和乳酸脅迫下，質子泵編碼基因pma1抒發(fā)量均明顯下調，這與酸脅迫導致的細胞質酸化密不可分。ABC家族轉運蛋白編碼基因pdr1在乳酸脅迫下明顯下調，而bfr1在磷酸脅迫下明顯下調，反映了這兩個同源基因對不同胺基的不同響應。從圖7b中，我們發(fā)覺在無酸條件下，基因mug86在pil1Δ中明顯上調，這表明了這個轉運體在的結構的重要性。而在酸脅迫下，WT和pil1Δ弧菌中mug86的抒發(fā)量較低，說明該基因并不是導致兩弧菌甲酸濃度差別的主要誘因。在乳酸脅迫下，pdr1抒發(fā)水平在pil1Δ中也有調低，但在磷酸脅迫下未見類似情況。
圖7.組裝狀態(tài)對關鍵膜蛋白和細胞壁完整性的影響。(a)不同酸處理1小時膜蛋白編碼關鍵基因的相對抒發(fā)量的變化。(b)組裝狀態(tài)的影響關鍵膜蛋白編碼基因的抒發(fā)研究。(c)不同pH條件下溴酚藍堿液的吸光度（590nm）(d)通過獼猴桃糖依賴的培養(yǎng)基酸化測定WT和pil1Δ的Pma1質子泵活性。(e)坦桑尼亞紅敏感性試驗。CK(對照檢測)表示無酸AA為8g/L磷酸，LA為40g/L乳酸。
據悉，筆者還剖析了維持細胞內pH值的關鍵元素質子泵Pma1的酶活性是否受形態(tài)變化的影響(圖7c和7d)。結果表明，WT和pil1Δ經過饑餓處理后，獼猴桃糖的補充誘導Pma1的激活，將胞內H+排除到胞外。培養(yǎng)基pH在培養(yǎng)過程中逐步增加并趨向穩(wěn)定。在WT和pil1Δ的培養(yǎng)體系中，盡管pH值在30min和300min有明顯差別，但在其他時間點無明顯差別。
細胞壁是酵母抵擋外界環(huán)境干擾的第一道屏障。細胞壁的孔隙率對于乙酸步入細胞的擴散速度也很重要。因而，也考慮了破壞是否影響細胞壁完整性。以pmk1(一種編碼細胞壁完整性通路的關鍵激酶)缺位突變體作為對照。從圖7e可以看出，在無酸條件下，pmk1和pil1的缺位并不影響弧菌的生長。與WT相比，在2mg/mL坦桑尼亞紅的存在下，pmk1Δ的生長顯著遭到抑制，而pil1Δ的生長與WT沒有差別，說明pmk1的遺失造成細胞膜完整性的損傷，而的破壞不影響細胞壁完整性。故WT和pil1Δ中乙酸濃度的差別與上述膜蛋白和細胞壁沒有明顯關系。
破壞對脂類組成的影響
為了闡述對細胞膜的影響，筆者對細胞膜脂類組成進行了剖析。采用電噴霧電離（ESI）正、負離子模式共檢出714種脂類分子，涉及31個亞類。測定結果顯示，WT和pil1Δ突變株的總脂類濃度分別為48.22±1.36和44.59±2.66mg/g，二者之間無明顯差別(p≈0.103)。
甘油磷脂是最大的一類膜脂。WT突變株的甘油磷脂總濃度(45.08±1.29mg/g)與pil1Δ突變株的甘油磷脂總濃度(41.77±2.45mg/g)相仿，且均小于93%。
在亞類方面，與WT相比，pil1的缺位明顯增加了PC、PS、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油醇(PG)的相對產率，而PE和PC(LPC)的濃度明顯降低(圖5a)。的破壞并未造成鞘脂質物質出現(xiàn)較大的改變，僅有鞘磷脂由7.54±0.63μg/g下調至24.28±3.33μg/g。麥角甾醇濃度由63.80±7.62μg/g增長到42.13±7.05μg/g。除上述固醇外，pil1Δ中甘油酯類濃度也有所增長。
圖5改變了S.pombe的脂類結構。(a)WT和pil1Δ突變細胞中不同脂類亞類的分布。(b)具有不同不飽和鍵的固醇亞類的分布。(c)不同胺基鏈寬度的固醇分布。(d)OPLS-DA剖析得到的明顯不同固醇的分級降維(p<0.05,VIP>1)。
依據報導的吡啶鏈寬度分類，發(fā)覺S.pombe膜脂以超長鏈糖類(C≥22)為主，其次是長鏈糖類(12≤C<21)和少量中短鏈酯類(C
為了篩選破壞導致的明顯差別的脂類標志物，采用正交偏最小二乘判定剖析()對實驗組間的差別進行可視化剖析。按照VIP>1和P<0.05的原則，在兩株菌中鑒別出32種不同的糖類(圖5d)。與WT相比，pil1Δ弧菌中LPC(8:0)+HCOO、LPC(10:0)+HCOO、LPC(12:0)+HCOO、LPC(16:0)+HCOO、LPC(16:0)+H等飽和脂類均有所降低。產率增加的固醇主要有PS、PC和PI，其中PI亞型最多。
總結
筆者覺得破壞導致的細胞膜與核糖信息交流中斷可能是造成弧菌耐堿性能增長的直接誘因，并對參與弧菌抵抗有機酸脅迫的機制進行了推算（圖6）。磷酸、乳酸以未解離的方式步入胞內造成滲透壓變化，進而導致細胞膜張力發(fā)生改變。進一步，通過組裝狀態(tài)的改變與VAPs進行溝通，間接地將壓力訊號傳遞至葉綠體，調節(jié)核糖的重構，以維持胞內脂類的穩(wěn)態(tài)和細胞膜的完整性，降低有機酸步入胞內的流量。
圖6參與細胞抵抗有機酸脅迫的分子機制
版面設計馬雨鑫
二審/校稿林良才
一審崔琬晶
三審張翠英