免疫螢光技術（）又稱螢光抗原技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物物理和顯微鏡技術的基礎上完善上去的一項技術。很早以來就有一些學者企圖將抗原分子與一些示蹤物質結合，借助抗體抗原反應進行組織或細胞內抗體物質的定位。它是按照抗體抗原反應的原理，先將已知的抗體或抗原標記上螢光官能團，再用這些螢光抗原（或抗體）作為探針檢測細胞或組織內的相應抗體（或抗原）。借助螢光顯微鏡可以看到螢光所在的細胞或組織，進而確定抗體或抗原的性質和定位。
一、基本原理：
免疫螢光技術是按照抗體抗原反應的原理，先將已知的抗體或抗原標記上螢光素，制成螢光抗原，再用這些螢光抗原（或抗體）作為探針測量組織或細胞內的相應抗體（或抗原）。在組織或細胞內產生的抗體抗原復合物上富含標記的螢光素，借助螢光顯微鏡觀察標本，螢光素受外來迸發光的照射而發生明亮的螢光（黃紅色或橘黃色），可以看到螢光所在的組織細胞，進而確定抗體或抗原的性質、定位，以及借助定量技術測定純度。
二、應用范圍：
其應用范圍非常廣泛，可以測定內分泌激素、蛋白質、多肽、核酸、神經遞質、受體、細胞因子、細胞表面抗體、腫瘤標志物、血藥含量等各類生物活性物質。按照確診類別，又可分為傳染性疾患、內分泌、腫瘤、藥物檢查、免疫學、血型鑒別等。
三、基本實驗步驟：
1、細胞打算。對雙層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成雙層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對漂浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心漂洗（,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞活檢。
2、固定。按照須要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可放在含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS漂洗3×5min.
3、通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，通常須要在加入抗原孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗原才能抵達抗體部位。選擇通透劑應充分考慮抗體蛋白的性質。通透的時間通常在5-15min.通透后用PBS漂洗3×5min.
4、封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間通常為30min.
5、一抗結合。溫度孵育1h或則4℃過夜。PBST洗滌3次，每次沖洗5min.
6、二抗結合。間接免疫螢光須要使用二抗。溫度避光孵育1h.PBST洗滌3次，每次沖洗5min后，再用分餾水洗滌一次。
7、封片及測量。滴加封丸劑一滴，封片，螢光顯微鏡檢測。
四、注意事項：
1、染完以后沒有封片前直接照一些，由于有的時侯可能封片會出現問題，再想照反倒沒有了，另外不要拖太長時間，螢光會崔滅的。
2、熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時間一直能照出挺好的片子。
3、二抗用之前一定離心，不然有的時侯有那個沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性螢光光點，特別難看。
4、整個操作在4℃下進行，漂洗液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN３細胞膜抗原，上述實驗條件是避免一抗結合細胞膜抗體后發生交聯、脫落。
5、洗滌要充分，以防止游離抗原封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陽性。
6、加適量正常兔血漿可封閉個別細胞表面免疫球蛋白Fc受體，增加和避免非特異性染色。
7、細胞活性要好，否則易發生非特異性螢光染色。抗淬滅劑可用來直接封片,20下挫即可，然后片子可保留更長時間。
五、熒光物質：
1、熒光色素
許多物質都可形成螢光現象，但并非都可用作螢光色素。只有這些能形成顯著的螢光并能作為顏料使用的有機化合物能夠稱為免疫螢光色素或螢光顏料。常用的螢光色素有：
(1)異硫氰酸螢光素（anate，FITC）為紅色或橙紅色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490--495nm，最大發射光波長520--530nm，呈現明亮的黃紅色螢光，有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的螢光素。其主要優點是：①人眼對黃紅色較為敏感，②通常切塊標本中的紅色螢光多于黑色。
(2)四甲基羅丹明（，）為橘黃色粉末，不溶于水，易溶于酒精和乙酸。性質穩定，可常年保存。最大吸收光波長為570nm，最大發射光波長為595～600nm，呈橘黃色螢光。
(3)四苯基異硫氰酸羅丹明（，TRITC）
最大吸引光波長為550nm，最大發射光波長為620nm，呈橙黃色螢光。與FITC的翠紅色螢光對比鮮明細胞膜抗原，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫羰基可與蛋白質結合，但螢光效率較低。
2、其他螢光物質
（1）酶作用后形成螢光的物質個別化合物本身無螢光效應，一旦經酶作用便產生具有強螢光的物質。諸如4-羥基傘酮-β-D半乳香豆素受β-半乳香豆素酶的作用分解成4-羥基傘酮，前者可發出螢光，迸發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如酸性酸酶的底物4-羥基傘酮乙酸鹽和辣根二溴化物酶的底物對氨基苯甲酸等。
（2）鑭系螯合物個別3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經迸發后也可發射特點性的螢光，其中以Eu3應用最廣。Eu3
螯合物的迸發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，螢光衰變時間長，最適宜用于區分螢光免疫測定。
六、常見螢光素的特點：
1、FITC：白色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發射光：520~530nm，明亮的黃紅色螢光。
2、RB200：橘黃色粉末,吸收光570nm，發射光595~600nm，橘黃色螢光。
3、TRITC：紫灰色粉末，吸收550nm，發射光620nm，橙黃色螢光。
4、鑭系：Eu、Tb
5、PE：吸收光490~560nm，發射光595nm，綠色螢光。
6、其它：酶作用后形成螢光物質。