免疫螢光技術(shù)（）又稱螢光抗原技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物物理和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上完善上去的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者企圖將抗原分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，借助抗體抗原反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗體物質(zhì)的定位。它是按照抗體抗原反應(yīng)的原理，先將已知的抗體或抗原標(biāo)記上螢光官能團(tuán)，再用這些螢光抗原（或抗體）作為探針檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體（或抗原）。借助螢光顯微鏡可以看到螢光所在的細(xì)胞或組織，進(jìn)而確定抗體或抗原的性質(zhì)和定位。
一、基本原理：
免疫螢光技術(shù)是按照抗體抗原反應(yīng)的原理，先將已知的抗體或抗原標(biāo)記上螢光素，制成螢光抗原，再用這些螢光抗原（或抗體）作為探針測(cè)量組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗體（或抗原）。在組織或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的抗體抗原復(fù)合物上富含標(biāo)記的螢光素，借助螢光顯微鏡觀察標(biāo)本，螢光素受外來迸發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的螢光（黃紅色或橘黃色），可以看到螢光所在的組織細(xì)胞，進(jìn)而確定抗體或抗原的性質(zhì)、定位，以及借助定量技術(shù)測(cè)定純度。
二、應(yīng)用范圍：
其應(yīng)用范圍非常廣泛，可以測(cè)定內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗體、腫瘤標(biāo)志物、血藥含量等各類生物活性物質(zhì)。按照確診類別，又可分為傳染性疾患、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢查、免疫學(xué)、血型鑒別等。
三、基本實(shí)驗(yàn)步驟：
1、細(xì)胞打算。對(duì)雙層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成雙層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)漂浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心漂洗（,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞活檢。
2、固定。按照須要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可放在含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS漂洗3×5min.
3、通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，通常須要在加入抗原孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗原才能抵達(dá)抗體部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗體蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間通常在5-15min.通透后用PBS漂洗3×5min.
4、封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間通常為30min.
5、一抗結(jié)合。溫度孵育1h或則4℃過夜。PBST洗滌3次，每次沖洗5min.
6、二抗結(jié)合。間接免疫螢光須要使用二抗。溫度避光孵育1h.PBST洗滌3次，每次沖洗5min后，再用分餾水洗滌一次。
7、封片及測(cè)量。滴加封丸劑一滴，封片，螢光顯微鏡檢測(cè)。
四、注意事項(xiàng)：
1、染完以后沒有封片前直接照一些，由于有的時(shí)侯可能封片會(huì)出現(xiàn)問題，再想照反倒沒有了，另外不要拖太長(zhǎng)時(shí)間，螢光會(huì)崔滅的。
2、熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時(shí)間一直能照出挺好的片子。
3、二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)侯有那個(gè)沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性螢光光點(diǎn)，特別難看。
4、整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行，漂洗液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３細(xì)胞膜抗原，上述實(shí)驗(yàn)條件是避免一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗體后發(fā)生交聯(lián)、脫落。
5、洗滌要充分，以防止游離抗原封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陽(yáng)性。
6、加適量正常兔血漿可封閉個(gè)別細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，增加和避免非特異性染色。
7、細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性螢光染色。抗淬滅劑可用來直接封片,20下挫即可，然后片子可保留更長(zhǎng)時(shí)間。
五、熒光物質(zhì)：
1、熒光色素
許多物質(zhì)都可形成螢光現(xiàn)象，但并非都可用作螢光色素。只有這些能形成顯著的螢光并能作為顏料使用的有機(jī)化合物能夠稱為免疫螢光色素或螢光顏料。常用的螢光色素有：
(1)異硫氰酸螢光素（anate，F(xiàn)ITC）為紅色或橙紅色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃紅色螢光，有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的螢光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃紅色較為敏感，②通常切塊標(biāo)本中的紅色螢光多于黑色。
(2)四甲基羅丹明（，）為橘黃色粉末，不溶于水，易溶于酒精和乙酸。性質(zhì)穩(wěn)定，可常年保存。最大吸收光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘黃色螢光。
(3)四苯基異硫氰酸羅丹明（，TRITC）
最大吸引光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙黃色螢光。與FITC的翠紅色螢光對(duì)比鮮明細(xì)胞膜抗原，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲螋驶膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但螢光效率較低。
2、其他螢光物質(zhì)
（1）酶作用后形成螢光的物質(zhì)個(gè)別化合物本身無螢光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便產(chǎn)生具有強(qiáng)螢光的物質(zhì)。諸如4-羥基傘酮-β-D半乳香豆素受β-半乳香豆素酶的作用分解成4-羥基傘酮，前者可發(fā)出螢光，迸發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如酸性酸酶的底物4-羥基傘酮乙酸鹽和辣根二溴化物酶的底物對(duì)氨基苯甲酸等。
（2）鑭系螯合物個(gè)別3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)迸發(fā)后也可發(fā)射特點(diǎn)性的螢光，其中以Eu3應(yīng)用最廣。Eu3
螯合物的迸發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，螢光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適宜用于區(qū)分螢光免疫測(cè)定。
六、常見螢光素的特點(diǎn)：
1、FITC：白色結(jié)晶粉末，吸收光：490~495nm，發(fā)射光：520~530nm，明亮的黃紅色螢光。
2、RB200：橘黃色粉末,吸收光570nm，發(fā)射光595~600nm，橘黃色螢光。
3、TRITC：紫灰色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙黃色螢光。
4、鑭系：Eu、Tb
5、PE：吸收光490~560nm，發(fā)射光595nm，綠色螢光。
6、其它：酶作用后形成螢光物質(zhì)。