實驗材料
膠原酶
試劑、試劑盒
儀器、耗材
離心機
實驗步驟
一、用膠原酶/EDTA釋放細胞
1.用預保溫堿液漂洗雙層細胞并用膠原酶處理
(1)預保溫堿液漂洗細胞。
預保溫堿液：
5mmol/LEDTA谷氨酸鈉溶于HBSS，不含二價陽離子。
(2)在雙層細胞上加1%的膠原酶堿液，在37℃保溫30分鐘，時常搖晃。
1%膠原酶：
IV型膠原酶（Sigma)溶化在含1mmol/LCaCl2的1%的BSA/HBSS堿液中，含Mg2+，配成1％的膠原酶堿液。堿液經過濾抑菌并保存在-20℃直到使用，防止反復凍融。
(3)加1mol/LEDTA谷氨酸鈉（pH8)。使終含量為5~10mmol/L。保溫到細胞變圓，一般須要30分鐘。
(4)用臨床臺式離心機250g溫和離心2~3分鐘以搜集細胞。溫度也可以接受，但最好在4℃進行。開始分離細胞膜之前起碼用HBSS/EDTA堿液漂洗細胞一次再將細胞均勻地漂浮在小容積（1~2ml)的第2步中所描述的細胞膜包被緩沖液（PMCB)中。
2.打算下述堿液：
30%的陽離子硅膠儲存液可以依據和(1983)的方式制備。
3.取剛才漂洗過的起碼含5x106個細胞的來自第一步的單細胞懸液。
4.用臨床臺式離心機900g離心2~3分鐘沉淀細胞，最好在4℃，溫和地將細胞重新漂浮于1mlPMCB緩沖液中。避免細胞斷裂。從此刻到第9步，倘若發生了細胞斷裂，細胞器和細胞碎片可能會與細胞膜一齊被分離，這是最大的污染源。
5.—滴一滴地將細胞飄浮液加到5ml1%的陽離子硅膠PMCB氨水中，同時在一個50ml的錐形離心管中輕輕混旋氨水。注意是細胞加到陽離子硅膠中而不是硅膠加到細胞中。所有細胞加完后，用PMCB緩沖液稀釋氫氧化鋁包被的細胞漂浮液到20ml。
6.900g離心3分鐘沉淀硅膠包被的細胞。棄掉富含氫氧化鋁的均勻混濁而不是混凝狀的上清。沉淀物應當致密而不是卷發的，假如沉淀顯著呈混凝狀或卷發，可能發生了細胞裂解。為了獲得最好的結果，細胞在直至第7步的任何一個包被階段，在相差顯微鏡下觀察都應當是完整的。
7.當心漂浮細胞于20mlPMCB，重新于900g離心3分鐘沉淀細胞，棄掉上清，再當心漂浮細胞于20mlPMCB。最后900g離心3分鐘沉淀細胞，將細胞懸于1mlPMCB中。
8.—滴一滴地將重懸的硅膠包被的細胞加到輕輕混旋著的5ml1mg/mlPAA/PMCB氨水中，便于用PAA過度包被細胞。用PMCB將整個飄浮液稀釋到20ml。900g離心3分鐘沉淀細胞，棄掉上清，漂浮細胞于20ml。
9.900g離心3分鐘沉淀細胞，棄掉上清。
10.用振蕩器將細胞充分漂浮于1~5ml冰涼的補加了合適的蛋白酶抑制劑的低滲裂解緩沖液中，冰浴30分鐘，時常蜷曲。
11.在勻漿器中用緊密配套的研杵裂解細胞，用顯微鏡觀察一小滴氨水以監控裂解程度。假如細胞看上去抗此類處理的裂解，可能必須用Parr氣彈的液氮成孔作用(and1983)或用細胞裂解器來機械裂解。
12.分離裂解物以獲得細胞膜。
(1)一步分離的方式
①用等容積100%的稀釋細胞裂解物，將獲得的含50%(比重1.25)的稀釋物鋪到5ml離心管中的0.5ml70%氨水（比重1.37)上用裂解緩沖液加滿離心管，裂解緩沖液中的溶質一般使其比重為1.03。
②在吊桶式扭頭（如,)中60000g離心20分鐘沉淀細胞膜。
③陽離子硅膠包被的細胞膜出現在管底的沉淀中。細胞核和完整的硅膠包被的細胞在50%/70%的交界面，細胞質蛋白一般漂浮在50%氨水中，內膜一般懸浮在50%與裂解緩沖液的交界面。假如要從50%與裂解緩沖液的交界面搜集內部蛋白，可以用4倍容積的裂解液稀釋后60000g離心60分鐘以沉淀之。細胞膜如第11步描述的那樣搜集。
(2)兩步分離方式
①裂解后（第9步），900g離心10分鐘沉淀陽離子硅膠包被的細胞膜。沉淀將包栝硅膠包被的密度大的細胞膜片和細胞核細胞膜圖片，上清中包括內膜片和可溶蛋白質。內膜可以用高速離心（50000g)來搜集。
②重懸沉淀于4ml裂解緩沖液中并鋪于70%的氨水上。在吊桶式扭頭(如，)中28000g離心30分鐘。硅膠包被的細胞膜很容易經過70%的堿液而沉淀出來細胞膜圖片，并照第11步描述的那樣搜集。
13.當心清除所有上清以解搜集管底沉積的硅膠包被的細胞膜。硅膠包被的細胞膜幾乎看不到，但加1ml裂解緩沖液后才會顯著看到玻璃狀灰黃色的沉淀。重懸沉淀于1ml裂解緩沖液中。
14.將重懸的硅膠包被的細胞膜轉移到5ml錐形離心管中，起碼三次用1ml裂解緩沖液漂洗沉淀。假如下一步要確定蛋白質含量，必須完全去除，強烈干擾幾種蛋白質含量定量技巧，包括Lowry法和雙縮脲法。這時分離的細胞膜可以用于要求非變性蛋白質的生化剖析。
15.在2%SDS氨水中煮熟硅膠包被的細胞膜5分鐘以溶化膜蛋白。假如熬煮之前先將沉淀均勻漂浮于含2%SDS的裂解緩沖液中并用超聲波簡略處理沉淀，每間隔6秒超聲10秒鐘，共超聲處理5次。會獲得最佳蛋白產值。
16.用微型離心機高速離心10分鐘沉淀任何殘留的氫氧化鋁。
17.取出上清，其中富含溶化的細胞膜蛋白，除去氫氧化鋁沉淀。