來源|鐵死亡club
鐵元素除了是血紅蛋白、肌紅蛋白合成的主要原料，也是多種氧化還原酶類的輔因子。作為人體濃度最多的必需微量元素，鐵穩(wěn)態(tài)代謝對(duì)維持生命健康至關(guān)重要。原發(fā)性遺傳性暗紅病是鐵過載人類遺傳病，主要由HFE、HJV、TfR2、HAMP或FPN等鐵代謝調(diào)控基因突變引起多臟器鐵積聚，多累及損傷腎臟、肝臟和腎臟等重要器官，病人晚期多并發(fā)腎臟病、肝硬化或糖尿病等病癥，嚴(yán)重害處機(jī)體健康。
鐵泵蛋白（FPN）是迄今為止惟一已知的細(xì)胞鐵離子外排蛋白，它在十二指腸上皮細(xì)胞、小腸樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高抒發(fā)，其中小腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抒發(fā)最為豐富；FPN通過控制鐵離子的吸收、再循環(huán)和存儲(chǔ)來維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)。課題組前期借助基因敲除大鼠在國際上首先發(fā)覺并報(bào)導(dǎo)了FPN在巨噬細(xì)胞以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中調(diào)控鐵離子存儲(chǔ)和再循環(huán)的重要作用，并闡明FPN是上述組織細(xì)胞中外排鐵離子的關(guān)鍵通道蛋白。為了維持鐵離子代謝平衡進(jìn)而保障細(xì)胞和組織功能細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)劑，F(xiàn)PN的抒發(fā)遭到精密調(diào)控。鐵調(diào)素（HAMP基因編碼蛋白）是胰臟分泌的調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的核心激素，其作用靶向是FPN。當(dāng)與FPN結(jié)合時(shí)，F(xiàn)PN降解而喪失外排鐵離子功能，從而抑制十二指腸上皮細(xì)胞的鐵吸收及巨噬細(xì)胞的鐵再循環(huán)。一旦HAMP抒發(fā)被抑制或FPN功能失調(diào)，致使鐵外排功能異常，將引起機(jī)體鐵代謝衰弱疾患。
為此，結(jié)合FPN并誘導(dǎo)其降解，是FPN蛋白維持鐵穩(wěn)態(tài)代謝的根本機(jī)制[7]。初期研究提出，泛素化在FPN的降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是，結(jié)合并降解FPN的E3泛素化聯(lián)接酶至今是困惑領(lǐng)域的重大困局。
日前，四川學(xué)院醫(yī)大學(xué)王福俤/閔軍霞院士團(tuán)隊(duì)在血液學(xué)頂尖刊物Blood（IF=17.543）在線發(fā)表了題為：ironitsE3by的研究論文，首次闡述了鐵泵蛋白（FPN）在體內(nèi)外被降解的調(diào)控機(jī)制。
該研究篩選并發(fā)覺了新型E3泛素聯(lián)接酶介導(dǎo)了FPN的降解，于國際上率先制備了條件性敲除的大鼠模型，并首次闡明了通過調(diào)控FPN降解從而維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)代謝的新機(jī)制。據(jù)悉，該研究通過轉(zhuǎn)錄組及烷基化測(cè)序的方式首次解密了DNA去乙酰化名星分子Tet1響應(yīng)機(jī)體鐵衰弱，并通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控-FPN抒發(fā)，從而控制機(jī)體對(duì)于鐵路環(huán)境的響應(yīng)。
這一重磅發(fā)覺除了攻破了鐵代謝領(lǐng)域多年來仍未被解析的難點(diǎn)問題，同時(shí)為鐵衰弱相關(guān)病癥的預(yù)防提供了新靶向和新思路。
表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因抒發(fā)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等生命進(jìn)程中飾演重要角色。課題組前期研究表明，表觀遺傳調(diào)控同樣參與了機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的維持。為了明晰機(jī)體鐵代謝衰弱過程中的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)控分子，該研究通過對(duì)高低鐵膳食籠養(yǎng)的鐵衰弱大鼠模型進(jìn)行全基因組烷基化測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選，發(fā)覺DNA去羧基化酶Tet1參與了大鼠對(duì)于鐵路環(huán)境的響應(yīng)。
Tet1參與大鼠對(duì)于鐵路剌激的響應(yīng)
進(jìn)一步給與Tet1敲除大鼠鐵路剌激，該大鼠出現(xiàn)類似暗紅病的表型細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)劑，主要表現(xiàn)為血漿鐵及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度下降，腎臟鐵降低，但是肝臟及小腸上皮細(xì)胞鐵離子降低的現(xiàn)象。通過測(cè)量鐵調(diào)素及其他鐵代謝調(diào)節(jié)基因抒發(fā)水平，研究者發(fā)覺Tet1缺位造成FPN蛋白在小腸上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞積聚，從而引起大鼠鐵代謝衰弱。有趣的是，Tet1并非直接通過調(diào)控或FPN的轉(zhuǎn)錄來介導(dǎo)機(jī)體的鐵穩(wěn)態(tài)代謝。
Tet1基因敲除大鼠鐵代謝衰弱
為了深入探究Tet1調(diào)控FPN抒發(fā)的分子機(jī)制，研究者測(cè)量大鼠原代巨噬細(xì)胞中FPN降解情況，發(fā)覺Tet1缺少造成FPN蛋白積聚、泛素化水平減小，表明Tet1通過泛素化降解路徑調(diào)控FPN抒發(fā)。但是，F(xiàn)PN怎樣被降解仍屬于鐵代謝領(lǐng)域的未知。為明晰既能促使FPN泛素化降解又能被Tet1調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，該研究采用單向篩選的方式：借助酵母雙雜交技術(shù)在E3聯(lián)接酶文庫中篩選與FPN結(jié)合的蛋白，并進(jìn)一步在喂奶植物細(xì)胞中驗(yàn)證互相作用；同時(shí)在Tet1敲除體系的數(shù)據(jù)庫中篩選潛在的靶基因。通過基因疊加剖析及后續(xù)的表觀遺傳修飾剖析，研究者篩選出既能被Tet1調(diào)控，又能與FPN結(jié)合的E3聯(lián)接酶。
可能是Tet1調(diào)控的降解FPN的E3聯(lián)接酶
這么是否調(diào)控了FPN的泛素化降解呢？為了回答這一問題，研究者首先在體外檢查了對(duì)于FPN的調(diào)控作用，結(jié)果顯示外源明顯推動(dòng)了蛋白酶體及溶酶體依賴的FPN的泛素化降解，功能性缺位或突變的酶活位點(diǎn)，該降解作用顯著被抑制。上述結(jié)果闡明了FPN是的作用靶向。
推動(dòng)FPN降解
為了進(jìn)一步明晰的生理功能，研究者分別建立了巨噬細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞特異性缺位的基因敲除大鼠（/Lysm和/）。令人驚奇的是，/Lysm和/大鼠表現(xiàn)出與Tet1敲除大鼠類似的對(duì)鐵路響應(yīng)異常的鐵代謝衰弱表型，表明其在鐵穩(wěn)態(tài)代謝調(diào)控中的重要作用。通過分離大鼠原代巨噬細(xì)胞，研究者發(fā)覺缺位造成FPN降解減小。因?yàn)槭钦T發(fā)FPN發(fā)生內(nèi)攻占降解的重要分子，為闡明在-FPN調(diào)控軸中的關(guān)鍵作用，研究者給與/Lysm大鼠注射或激活劑LPS，結(jié)果顯示缺位明顯抑制了依賴的FPN降解。上述結(jié)果既明晰了體內(nèi)在調(diào)控的FPN降解中的重要作用，同時(shí)提示有望成為-FPN相關(guān)鐵代謝衰弱疾患的醫(yī)治靶向。
巨噬細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞特異性敲除
其實(shí)，這項(xiàng)研究于國際上首次發(fā)覺并報(bào)導(dǎo)了調(diào)控FPN降解的E3泛素聯(lián)接酶。該成果成功制備了條件性敲除大鼠，于體內(nèi)外探求并闡明了調(diào)控FPN降解及鐵穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制；該成果提出了Tet1--FPN軸響應(yīng)機(jī)體鐵路負(fù)荷的新機(jī)制，除了彌補(bǔ)了鐵代謝研究領(lǐng)域關(guān)于FPN降解調(diào)控的空白，同時(shí)為鐵代謝衰弱相關(guān)疾患的預(yù)防提供了新靶向和新策略。
Tet1--FPN調(diào)控軸模式圖
王福俤團(tuán)隊(duì)博士后蔣麗和博士生王佳明為論文共同第一作者；四川學(xué)院王福俤院士、閔軍霞院長為共同通信作者。此項(xiàng)研究得到中國科大學(xué)生物物理與細(xì)胞生物學(xué)研究所胡榮貴研究員、浙江學(xué)院生命科學(xué)研究院金建平研究員、浙江學(xué)院醫(yī)大學(xué)孫啟明院士、浙江學(xué)院實(shí)驗(yàn)植物中心洪勝輝以及醫(yī)大學(xué)公共技術(shù)平臺(tái)陳靜瑤的大力幫助。項(xiàng)目遭到國家重點(diǎn)研制計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金以及中國博士后科學(xué)基金的經(jīng)費(fèi)支助。
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