本發(fā)明涉及生物材料、組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞膜片及其制備方式與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
皮膚外傷是臨床易發(fā)病癥，可以分為急性外傷或則慢性外傷。人體對(duì)于傷口有一定的自我修補(bǔ)能力，而且當(dāng)傷口面積過(guò)大或則傷口局部環(huán)境衰弱諸如血管被破壞，血供不足時(shí)，傷口便難以正常修補(bǔ)，甚至導(dǎo)致常年無(wú)法結(jié)疤、反復(fù)發(fā)作的傷口。
已有廣泛的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了組織工程中運(yùn)用人自身的細(xì)胞來(lái)修補(bǔ)人體組織的研究進(jìn)展，借助細(xì)胞來(lái)進(jìn)行組織修補(bǔ)早已取得了一些成果，這是借助外加細(xì)胞自身參與到修補(bǔ)過(guò)程中，借助其生長(zhǎng)因子和蛋白等來(lái)進(jìn)行組織的修補(bǔ)，并且其修補(bǔ)能力有限，且須要合適的支架材料作為細(xì)胞載體。
定向靜電紡紗纖維膜具有與細(xì)胞外基質(zhì)相像的結(jié)構(gòu)和規(guī)格，在組織再生及修補(bǔ)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。定向靜電紡紗纖維膜被否認(rèn)才能影響細(xì)胞的定向排列及生長(zhǎng)，并且僅作為支架材料而未涉及生物活性成分，其組織再生修補(bǔ)能力有限。據(jù)悉，在皮膚傷口修補(bǔ)領(lǐng)域，其常被用作保護(hù)傷口的敷料，并不具備生物活性或修補(bǔ)能力。
生物活性玻璃是一種硅基無(wú)機(jī)材料，在組織修補(bǔ)領(lǐng)域獲得了好多應(yīng)用。生物活性玻璃被證明可以促使體內(nèi)外血管化，臨床上也出現(xiàn)了基于生物活性玻璃粉末的傷口修補(bǔ)產(chǎn)品。并且因?yàn)樗勰┑男再|(zhì)，很難固定在傷口位置，且其形成的局部酸性物理環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致患者的不適。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種具有良好再生修補(bǔ)能力的細(xì)胞膜片及其制備方式與應(yīng)用，其具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞膜片，所述細(xì)胞膜片由定向靜電紡紗纖維膜和經(jīng)生物活性玻璃離子產(chǎn)物活化的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞組成。
進(jìn)一步地，所述定向靜電紡紗纖維膜由聚己香豆素/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)組成。
進(jìn)一步地，所述定向靜電紡紗纖維膜的納米纖維規(guī)格與細(xì)胞外基質(zhì)相像。
進(jìn)一步地，所述生物活性玻璃富含CaO、P2O5和SiO2，所述生物活性玻璃的浸提液富含Ca、P和Si離子。
本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞膜片在制備傷口保護(hù)輔料中的應(yīng)用，及其在制備心肌修補(bǔ)材料中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述細(xì)胞膜片的制備方式，包括以下步驟：
步驟1、利用高速旋轉(zhuǎn)滾筒搜集聚己香豆素/外消旋聚乳酸(PCL/PDLLA)電紡紗得到定向靜電紡紗纖維膜；
步驟2、將生物活性玻璃粉體分別加入無(wú)血漿成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液和無(wú)血漿內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，無(wú)菌過(guò)濾搜集生物活性玻璃浸提液，分別用所述無(wú)血漿成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液和所述無(wú)血漿內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液等比列稀釋后以1：1容積比混和，得到稀釋的生物活性玻璃浸提液；
步驟3、將所述定向靜電紡紗纖維膜剪裁成適合大小細(xì)胞膜片，殺菌處理后放在培養(yǎng)板，加入成纖維細(xì)胞漂浮液，用所述稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)1d，移除培養(yǎng)液，加入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞漂浮液，用所述稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)3d，移除培養(yǎng)液；
步驟4、取出所述定向靜電紡紗纖維膜，制備得到由所述定向靜電紡紗纖維膜和經(jīng)生物活性玻璃離子產(chǎn)物活化的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞組成的所述細(xì)胞膜片。
進(jìn)一步地，所述高速旋轉(zhuǎn)滾筒的怠速為2000r/min。
進(jìn)一步地，所述稀釋的生物活性玻璃浸提液中的主要離子含量如下：Ca：65.05±0.35μg/ml，P：28.55±0.22μg/ml，Si：1.01±0.07μg/ml。
進(jìn)一步地，每平方分米所述定向靜電紡紗纖維膜上加入的成纖維細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目分別為3x104-4x104和4x104-5x104。
本發(fā)明的有益療效在于：
本發(fā)明不需額外使用特殊培養(yǎng)皿或技術(shù)手段，借助定向靜電紡紗纖維膜通過(guò)通常培養(yǎng)方式制備得到微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片，該膜片具有很高的生物活性，才能分泌成血管相關(guān)的生長(zhǎng)因子和蛋白如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(KDR)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及一系列細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白()、彈性蛋白()、纖連蛋白()來(lái)促使創(chuàng)口修補(bǔ)。在實(shí)際運(yùn)用中，借助該膜片才能推動(dòng)鳥(niǎo)類全切傷口處膠原蛋白沉積和血管再生，但是能促使傷口收縮，顯著地提升傷口修補(bǔ)速率，其對(duì)慢性外傷的修補(bǔ)尤其具有良好的修補(bǔ)療效。
以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)特點(diǎn)和技術(shù)療效。
附圖說(shuō)明
圖1示出了本發(fā)明的一個(gè)較佳施行例的傷口修補(bǔ)療效；
圖2示出了本發(fā)明的一個(gè)較佳施行例的傷口收縮率結(jié)果；
圖3示出了本發(fā)明的一個(gè)較佳施行例的修補(bǔ)過(guò)程中血管再生情況；
圖4.示出了本發(fā)明的一個(gè)較佳施行例的膠原蛋白I在傷口位置沉積情況。
具體施行方法
下邊結(jié)合附圖和具體的施行例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳盡描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這種施行例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制發(fā)明的范圍。
施行例1
1.制備定向靜電紡紗纖維膜，將質(zhì)量比為1:1的PCL和PDLLA以4.8％的質(zhì)量容積比溶化于容積比為4：1的DMF和THF中，借助靜電紡紗設(shè)備以10kv電流、0.02ml/min流量和12cm接收距離的條件進(jìn)行電紡紗，以2000r/min旋轉(zhuǎn)的高速滾筒接收得到定向靜電紡紗纖維膜。
2.制備生物活性玻璃浸提液，分別將1g生物活性玻璃粉體加入5ml無(wú)血漿成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液及5ml無(wú)血漿內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后無(wú)菌過(guò)濾搜集，并分別用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液以1/128比列稀釋，將稀釋后浸提液以1：1容積比混和；
3.定向靜電紡紗纖維膜裁剪成2.5cmx2.5cm大小，并于75％酒精中浸洗30分鐘進(jìn)行殺菌處理，殺菌并瀝干的定向靜電紡紗纖維膜放在培養(yǎng)板并加入2x105個(gè)成纖維細(xì)胞飄浮液，用稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)24小時(shí)，之后移除培養(yǎng)液并加入3x105個(gè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞飄浮液，用稀釋的生物活性玻璃浸提液培養(yǎng)3天細(xì)胞膜片，移除培養(yǎng)液，取出電紡膜，制備得到由微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片待用；
4.在裸鼠頭部制造兩個(gè)半徑1cm的傷口，將制備的細(xì)胞膜片施加到傷口，并設(shè)置空白組和施加0.1grhEGF凝膠的陰性對(duì)照；
5.裸鼠靜脈注射(20mg/kgBW)減緩傷口結(jié)疤，2d、7d、14d后誅殺裸鼠，搜集傷口樣本做切塊剖析。
施行例2
按照施行例1所示的方式，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠頭部的傷口半徑進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)公式：傷口收縮％＝100×(初始傷口面積—目前傷口面積)/初始傷口面積，對(duì)傷口收縮率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果示于圖2。
施行例3
按照施行例1所示的方式，對(duì)搜集的傷口樣本進(jìn)行CD31免疫組織物理染色，觀察到由微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片修補(bǔ)的傷口有大量的血管再生，結(jié)果示于圖3a。圖3b示出了其定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
施行例4
按照施行例1所示的方式，對(duì)搜集的傷口樣本進(jìn)行I免疫組織物理染色，觀察到由微結(jié)構(gòu)和生物材料活化的細(xì)胞膜片修補(bǔ)的傷口有大量的膠原蛋白沉積，結(jié)果示于圖4。
以上詳盡描述了本發(fā)明的較佳具體施行例。應(yīng)該理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以按照本發(fā)明的構(gòu)思做出眾多更改和變化。因而，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯剖析、推理或則有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)力要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。