光透過某一物質(zhì)時(shí),個(gè)別波長(zhǎng)的光被該物質(zhì)吸收,因而在連續(xù)波譜中有一段或幾段波長(zhǎng)的光減小了或消失了，這些波譜稱為吸收波譜。不同物質(zhì)的吸收波譜不同，這取決于物質(zhì)的分子、原子和原子團(tuán)，因而可用吸收波譜來分辨物質(zhì)和推斷樣品的結(jié)構(gòu)；同時(shí)吸收波譜的強(qiáng)弱和物質(zhì)的含量有關(guān)，這個(gè)性質(zhì)可拿來做定量剖析。
原理入射光(I0)經(jīng)過均勻而透明的堿液時(shí)，一部份光被溶質(zhì)吸收(IA)，一小部份被反射(IR),只有一部份可以透過(IT)。
I0＝IA＋I(xiàn)R＋I(xiàn)T在物理剖析中，常用一個(gè)"空白"堿液作為參考去校準(zhǔn)反射的光，則IR可以忽視不計(jì)。
I0＝IA＋I(xiàn)T此處I0又可以看作為透過"空白"的光硬度,由于"空白"是不吸收任何光的。所以IT/I0是透光率(T)，常用％來表示；但在實(shí)際應(yīng)用中，常常用光吸收(A)來表示。
A＝logI0／IT圖a是以T來表示的吸收波譜,而圖b是文獻(xiàn)中常見的以A表示的吸收波譜,從這兩個(gè)圖譜可以了解到T和A的關(guān)系。
當(dāng)某一物質(zhì)吸收一定波長(zhǎng)的光時(shí)，若此時(shí)A＝1，即其透過光的硬度為照射光的10％；若A＝2，表示含量大了一倍,其透過光的硬度為照射光的1％。按照貝爾定理，A＝ELC，A為光吸收，E為吸收系數(shù)，L為吸收杯光徑,C為含量。在堿液含量不很大的情況下，由光在堿液中被吸收的程度A，可以決定堿液的含量C，這就是吸收波譜定量剖析的原理。
分光光度計(jì)的構(gòu)造和性能分光光度計(jì)一般包括光源，分光系統(tǒng)和受光器等幾個(gè)主要部份：
光源通常340納米以上采用鎢燈作為燈源，340納米以下采用氫燈或氘燈作為燈源。在安裝時(shí)，鎢絲的位置要調(diào)節(jié)到剛好對(duì)準(zhǔn)入光狹縫，此時(shí)靈敏度最佳。
分光系統(tǒng)指把混和的燈源光分散成某些光波的裝置。通常是特殊玻璃或石英制的棱鏡；另一種色散系統(tǒng)是衍射光柵。
受光器一般是光電瓶或光電倍增管。透過光的能量通常是很小的，受光器能把它轉(zhuǎn)弄成電壓并放大，光電流的信號(hào)和強(qiáng)弱再用電壓計(jì)或記錄儀顯示或記錄出來。光狹縫有兩種表示方式，一種以毫米表示實(shí)際狹縫間距，另一種用波譜狹縫表示，單位是納米。狹縫愈小，光含量愈高，但透過的光硬度也愈弱，在實(shí)際應(yīng)用中要按照實(shí)驗(yàn)的要求加以調(diào)整。儲(chǔ)存樣品的吸收杯，在測(cè)可見光時(shí)可采用玻璃制的吸收杯，在測(cè)紫外部分時(shí)必須采用石英吸收杯。
常用的分光光度計(jì)是直接讀數(shù)或零點(diǎn)法，也有用記錄儀記錄的。
應(yīng)用任何物質(zhì)只要它有吸收波譜，就可以拿來做定性和定量剖析。
定性剖析按照樣品吸收曲線的形狀，并與已知物質(zhì)吸收波譜對(duì)比，可知其是否同一物質(zhì)。例如生物樣品中，蛋白質(zhì)吸收高峰通常在280納米,核苷酸一般吸收高峰在260納米。氧化型輔酶Ⅰ吸收高峰在260納米，而還原型輔酶Ⅰ在340納米出現(xiàn)一個(gè)新吸收峰。幾種不同的堿基，它們的250納米／260納米和280納米／260納米比值是各不相同的，可以便捷地區(qū)別開。
定量剖析①單組份定量，按照檢測(cè)到的樣品的光吸收值和已知的樣品消光系數(shù)，可以估算出樣品的量。②多組份剖析，假如樣品是個(gè)混和物，其中富含兩種或兩種以上的吸收物質(zhì)，這種物質(zhì)之間不起物理反應(yīng)，其吸收波譜其實(shí)相互重疊，但各自的吸收峰和峰谷是不同的，這樣可以不經(jīng)分離而直接用波譜法對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行定量測(cè)定。以兩個(gè)組分A和B的混和物為例，選擇二個(gè)波長(zhǎng)，一個(gè)是A組分的最大吸收(憶)，另一個(gè)是B組分的最大吸收(憻)，再分別以A和B堿液在這二個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)出各自的消光系數(shù)(E憶A、E憶B、E憻A和E憻b),之后再用混和物在這二波長(zhǎng)下測(cè)出光吸收A憶和A憻。因而
A憶＝E憶A·CA+E憶B·CCB
A憻＝E憻A·CA+E憻B·CB這兩個(gè)式中除CA和CB是未知含量外,其余光吸收(A)和消光系數(shù)(E)均為已測(cè)知數(shù)，解這聯(lián)立多項(xiàng)式,即可估算出含量CA和CB。③酶活性測(cè)定，當(dāng)酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物中有一個(gè)顯著的吸收波譜時(shí)，借測(cè)這個(gè)生色絡(luò)合物的出現(xiàn)或消失速率可以跟蹤酶的反應(yīng)。諸如氧化型和還原型輔酶Ⅰ的互變?cè)?40納米處有一個(gè)吸收峰的消失或生成，這一特點(diǎn)常常用于測(cè)定個(gè)別酯化酶的活性。
差波譜法差示分光光度法是測(cè)二種吸收波譜之差。其優(yōu)點(diǎn)是能檢出光吸收大的系統(tǒng)中比較小的光吸收變化。①當(dāng)被測(cè)定物質(zhì)含量很大，而又不能稀釋后再測(cè)定，這么測(cè)定的偏差都會(huì)很大。有些中級(jí)的分光光度計(jì)其實(shí)光吸收可以測(cè)到很高值，但也不能無限制的擴(kuò)大。這些情況下可采用略高于樣品含量的已知含量純物質(zhì)作為參考樣品放在空白對(duì)照光徑中，再進(jìn)行未知樣品含量的測(cè)定，致使欲測(cè)定樣品的讀數(shù)一直落在刻度盤讀數(shù)范圍內(nèi)。②在研究蛋白質(zhì)氫鍵中，蛋白質(zhì)或酶在加入作用物后，波譜會(huì)形成微小的變化，而蛋白質(zhì)本身含量常常較大，不容易察覺到這些微小變化。此時(shí)可在參考光徑中把酶和作用物分別放在二個(gè)吸收杯中，而在檢測(cè)光徑中把酶和作用物置于同一個(gè)吸收杯中，而檢測(cè)光徑中的第二個(gè)吸收杯中僅為相應(yīng)的緩沖液，這樣進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，可以清楚地觀察到個(gè)別波長(zhǎng)處的變化，并可定量。
波譜滴定滴定法中會(huì)有3個(gè)組分──滴定劑、被滴定物和生成物。只要這三個(gè)組分中任何一個(gè)組分有光吸收，且在滴定過程中光吸收會(huì)提高或減緩，則可借助波譜法測(cè)得其滴定終點(diǎn)，估算其含量。諸如滴定蛋白質(zhì)中某個(gè)多肽殘基數(shù)，可用相應(yīng)的試劑，每次加入一定容積后攪拌均勻并測(cè)其光吸收。雖然每次加入試劑體積極微吸收光譜，但仍需進(jìn)行容積校準(zhǔn)得到校準(zhǔn)后的光吸收值。以光吸收為縱座標(biāo)，滴定劑量為橫座標(biāo)，可以得到一個(gè)波譜滴定曲線，其轉(zhuǎn)折點(diǎn)即為滴定終點(diǎn)。以蛋白質(zhì)量與作用試劑的物理計(jì)量之比即可估算出此多肽殘基數(shù)。
在進(jìn)行波譜剖析時(shí)，不僅儀器本身的性能，以及使用不妥會(huì)影響到測(cè)定結(jié)果外，還有一些誘因也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例就像一樣品在不同溶劑中，它的吸收峰和消光系數(shù)常常不同；在不同PH下，波譜特點(diǎn)和光吸收也會(huì)有所變化。個(gè)別特殊情況下（比如酶反應(yīng)），氣溫也會(huì)影響到測(cè)定吸收光譜，都需加以注意。