光透過某一物質時,個別波長的光被該物質吸收,因而在連續波譜中有一段或幾段波長的光減小了或消失了，這些波譜稱為吸收波譜。不同物質的吸收波譜不同，這取決于物質的分子、原子和原子團，因而可用吸收波譜來分辨物質和推斷樣品的結構；同時吸收波譜的強弱和物質的含量有關，這個性質可拿來做定量剖析。
原理入射光(I0)經過均勻而透明的堿液時，一部份光被溶質吸收(IA)，一小部份被反射(IR),只有一部份可以透過(IT)。
I0＝IA＋IR＋IT在物理剖析中，常用一個"空白"堿液作為參考去校準反射的光，則IR可以忽視不計。
I0＝IA＋IT此處I0又可以看作為透過"空白"的光硬度,由于"空白"是不吸收任何光的。所以IT/I0是透光率(T)，常用％來表示；但在實際應用中，常常用光吸收(A)來表示。
A＝logI0／IT圖a是以T來表示的吸收波譜,而圖b是文獻中常見的以A表示的吸收波譜,從這兩個圖譜可以了解到T和A的關系。
當某一物質吸收一定波長的光時，若此時A＝1，即其透過光的硬度為照射光的10％；若A＝2，表示含量大了一倍,其透過光的硬度為照射光的1％。按照貝爾定理，A＝ELC，A為光吸收，E為吸收系數，L為吸收杯光徑,C為含量。在堿液含量不很大的情況下，由光在堿液中被吸收的程度A，可以決定堿液的含量C，這就是吸收波譜定量剖析的原理。
分光光度計的構造和性能分光光度計一般包括光源，分光系統和受光器等幾個主要部份：
光源通常340納米以上采用鎢燈作為燈源，340納米以下采用氫燈或氘燈作為燈源。在安裝時，鎢絲的位置要調節到剛好對準入光狹縫，此時靈敏度最佳。
分光系統指把混和的燈源光分散成某些光波的裝置。通常是特殊玻璃或石英制的棱鏡；另一種色散系統是衍射光柵。
受光器一般是光電瓶或光電倍增管。透過光的能量通常是很小的，受光器能把它轉弄成電壓并放大，光電流的信號和強弱再用電壓計或記錄儀顯示或記錄出來。光狹縫有兩種表示方式，一種以毫米表示實際狹縫間距，另一種用波譜狹縫表示，單位是納米。狹縫愈小，光含量愈高，但透過的光硬度也愈弱，在實際應用中要按照實驗的要求加以調整。儲存樣品的吸收杯，在測可見光時可采用玻璃制的吸收杯，在測紫外部分時必須采用石英吸收杯。
常用的分光光度計是直接讀數或零點法，也有用記錄儀記錄的。
應用任何物質只要它有吸收波譜，就可以拿來做定性和定量剖析。
定性剖析按照樣品吸收曲線的形狀，并與已知物質吸收波譜對比，可知其是否同一物質。例如生物樣品中，蛋白質吸收高峰通常在280納米,核苷酸一般吸收高峰在260納米。氧化型輔酶Ⅰ吸收高峰在260納米，而還原型輔酶Ⅰ在340納米出現一個新吸收峰。幾種不同的堿基，它們的250納米／260納米和280納米／260納米比值是各不相同的，可以便捷地區別開。
定量剖析①單組份定量，按照檢測到的樣品的光吸收值和已知的樣品消光系數，可以估算出樣品的量。②多組份剖析，假如樣品是個混和物，其中富含兩種或兩種以上的吸收物質，這種物質之間不起物理反應，其吸收波譜其實相互重疊，但各自的吸收峰和峰谷是不同的，這樣可以不經分離而直接用波譜法對各個組分進行定量測定。以兩個組分A和B的混和物為例，選擇二個波長，一個是A組分的最大吸收(憶)，另一個是B組分的最大吸收(憻)，再分別以A和B堿液在這二個波長下測出各自的消光系數(E憶A、E憶B、E憻A和E憻b),之后再用混和物在這二波長下測出光吸收A憶和A憻。因而
A憶＝E憶A·CA+E憶B·CCB
A憻＝E憻A·CA+E憻B·CB這兩個式中除CA和CB是未知含量外,其余光吸收(A)和消光系數(E)均為已測知數，解這聯立多項式,即可估算出含量CA和CB。③酶活性測定，當酶反應的底物或產物中有一個顯著的吸收波譜時，借測這個生色絡合物的出現或消失速率可以跟蹤酶的反應。諸如氧化型和還原型輔酶Ⅰ的互變在340納米處有一個吸收峰的消失或生成，這一特點常常用于測定個別酯化酶的活性。
差波譜法差示分光光度法是測二種吸收波譜之差。其優點是能檢出光吸收大的系統中比較小的光吸收變化。①當被測定物質含量很大，而又不能稀釋后再測定，這么測定的偏差都會很大。有些中級的分光光度計其實光吸收可以測到很高值，但也不能無限制的擴大。這些情況下可采用略高于樣品含量的已知含量純物質作為參考樣品放在空白對照光徑中，再進行未知樣品含量的測定，致使欲測定樣品的讀數一直落在刻度盤讀數范圍內。②在研究蛋白質氫鍵中，蛋白質或酶在加入作用物后，波譜會形成微小的變化，而蛋白質本身含量常常較大，不容易察覺到這些微小變化。此時可在參考光徑中把酶和作用物分別放在二個吸收杯中，而在檢測光徑中把酶和作用物置于同一個吸收杯中，而檢測光徑中的第二個吸收杯中僅為相應的緩沖液，這樣進行波長掃描，可以清楚地觀察到個別波長處的變化，并可定量。
波譜滴定滴定法中會有3個組分──滴定劑、被滴定物和生成物。只要這三個組分中任何一個組分有光吸收，且在滴定過程中光吸收會提高或減緩，則可借助波譜法測得其滴定終點，估算其含量。諸如滴定蛋白質中某個多肽殘基數，可用相應的試劑，每次加入一定容積后攪拌均勻并測其光吸收。雖然每次加入試劑體積極微吸收光譜，但仍需進行容積校準得到校準后的光吸收值。以光吸收為縱座標，滴定劑量為橫座標，可以得到一個波譜滴定曲線，其轉折點即為滴定終點。以蛋白質量與作用試劑的物理計量之比即可估算出此多肽殘基數。
在進行波譜剖析時，不僅儀器本身的性能，以及使用不妥會影響到測定結果外，還有一些誘因也會影響實驗結果。例就像一樣品在不同溶劑中，它的吸收峰和消光系數常常不同；在不同PH下，波譜特點和光吸收也會有所變化。個別特殊情況下（比如酶反應），氣溫也會影響到測定吸收光譜，都需加以注意。